SARS

Sep 02, 2023

Nature Band 592, Seiten 122–127 (2021)Diesen Artikel zitieren

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Während der Entwicklung von SARS-CoV-2 beim Menschen ist eine D614G-Substitution im Spike-Glykoprotein (S) aufgetreten; Das Virus, das diese Substitution enthält, ist zur vorherrschenden zirkulierenden Variante der COVID-19-Pandemie geworden1. Es bleibt jedoch unklar, ob die zunehmende Prävalenz dieser Variante einen Fitnessvorteil widerspiegelt, der die Replikation und/oder Übertragung beim Menschen verbessert, oder ob sie lediglich auf Gründereffekte zurückzuführen ist. Hier verwenden wir isogene SARS-CoV-2-Varianten, um zu zeigen, dass die Variante, die S(D614G) enthält, eine verstärkte Bindung an den menschlichen Zelloberflächenrezeptor Angiotensin-Converting-Enzym 2 (ACE2) und eine erhöhte Replikation im primären menschlichen Bronchial- und Nasenluftwegepithel aufweist Kulturen sowie in einem menschlichen ACE2-Knock-in-Mausmodell und deutlich erhöhte Replikation und Übertragbarkeit in Hamster- und Frettchenmodellen der SARS-CoV-2-Infektion. Unsere Daten zeigen, dass die D614G-Substitution in S zu einer geringfügigen Steigerung der Bindung und Replikation in vitro führt und in vivo einen echten Wettbewerbsvorteil bietet – insbesondere während des Übertragungsengpasses. Unsere Daten liefern somit eine Erklärung für die weltweite Dominanz der Variante, die S(D614G) enthält, unter den derzeit zirkulierenden SARS-CoV-2-Viren.

Ende 2019 wurde SARS-CoV-2 in Wuhan (Provinz Hubei, China)2,3 entdeckt und führte rasch zur COVID-19-Pandemie; Bis Dezember 2020 wurden 70 Millionen Fälle und 1,5 Millionen Todesfälle, die auf diese Krankheit zurückzuführen sind, bestätigt4. SARS-CoV-2 verursacht bei gefährdeten Personengruppen eine lebensbedrohliche Lungenentzündung5. Der Eintritt von SARS-CoV-2 in Zellen hängt von der Interaktion von S und ACE23,6 ab. S ist ein homotrimeres Klasse-I-Fusionsprotein, das aus zwei Untereinheiten (S1 und S2) besteht, die durch eine Protease-Spaltungsstelle getrennt sind. S1 bildet einen kugelförmigen Kopf und ist für die Rezeptorbindung unerlässlich, und S2 vermittelt die Fusion der Virushülle mit den Membranen der Wirtszelle. Beim Eintritt bindet die Rezeptorbindungsdomäne innerhalb der S1-Untereinheit ACE2, was Konformationsänderungen in der S2-Untereinheit erzeugt und die Internalisierung des Virus erleichtert7,8. S(D614G) ist eine Variante von S, die eine Substitution außerhalb der Rezeptorbindungsdomäne enthält, von der angenommen wird, dass sie eine Konformationsänderung im Protein verursacht, die die ACE2-Bindung verbessert und die Wahrscheinlichkeit einer Infektion erhöht1,9.

Mit fortschreitender Pandemie hat die SARS-CoV-2-Variante, die S(D614G) enthält (im Folgenden: SARS-CoV-2G614), die Elternvariante (mit D an der Aminosäureposition 614 von S; im Folgenden: SARS-CoV-2G614) schnell verdrängt. CoV-2D614) in der Häufigkeit, weltweit dominant zu werden. Eine solche Verschiebung der Genotyphäufigkeit könnte durch einen Gründereffekt nach der Einführung in eine stark vernetzte Population verursacht werden; Alternativ könnte SARS-CoV-2G614 einen Fitnessvorteil gegenüber SARS-CoV-2D614 haben. Einige Studien deuten darauf hin, dass die D614G-Substitution in S dem Virus einen Fitnessvorteil verschaffen könnte, indem sie den Zelleintritt verbessert8,9. Um die Rolle der D614G-Substitution in S bei der Verbreitung und Vorherrschaft von SARS-CoV-2G614 während der COVID-19-Pandemie zu untersuchen, haben wir die S-Bindung an menschliches ACE2 (hACE2) und die Replikationskinetik in vitro charakterisiert und die Infektions- und Übertragungsdynamik in untersucht vivo unter Verwendung von drei Tiermodellen. Unsere Daten zeigen, dass die D614G-Substitution in S eine erhöhte Bindung an den hACE2-Rezeptor und eine erhöhte Replikation in primären Epithelkulturen der menschlichen Atemwege bewirkt. Darüber hinaus zeigt der Vergleich rekombinanter isogener SARS-CoV-2-Varianten, dass die D614G-Substitution in S einen Wettbewerbsvorteil in einem hACE2-Knock-in-Mausmodell bietet und die Replikation und Übertragung in Syrischen Hamster- und Frettchenmodellen der SARS-CoV-2-Infektion deutlich erhöht .

Um die Auswirkungen der D614G-Substitution in S zu messen, haben wir zunächst die Bindung von S1-Domänenmonomeren an hACE2 mithilfe von Bioschichtinterferometrie quantifiziert. Sowohl S1 als auch S1(D614G) binden effizient an hACE2; S1 (D614G) zeigte jedoch eine etwa doppelt so hohe Affinität als S1 (Abb. 1a, Ergänzungstabelle 2). In ähnlicher Weise hatte S (D614G) eine höhere Affinität zu hACE2 als S, wenn Monomerformen voller Länge verwendet wurden (Erweiterte Daten, Abb. 1a, Ergänzungstabelle 2). Die D614G-Substitution in S führte auch zu einer verstärkten S1-Bindung an hACE2, das exogen in Babyhamster-Nierenzellen (im Folgenden BHK-hACE2-Zellen) exprimiert wird (Abb. 1b, erweiterte Daten, Abb. 1b). Die Bindung von Polyhistidin-markiertem S1 oder S1(D614G) an BHK-hACE2-Zellen zeigte, dass durch Durchflusszytometrie mehr S1(D614G) an BHK-hACE2-Zellen gebunden war als S1 (Abb. 1b, Extended Data Abb. 1b). Bei Verwendung homodimerer rekombinanter Konstrukte, die S1 an einem IgG-C-Terminus enthalten, beobachteten wir einen deutlicheren Effekt in der erhöhten Bindung des S1(D614G)-Proteins an die BHK-hACE2-Zelle (Abb. 1b, Extended Data Abb. 1b).

a, Affinität zwischen S1 und hACE2, bestimmt durch Biolayer-Interferometrie. Fc-markiertes ACE2-Protein wurde auf die Oberfläche von Anti-Human-Fc-Einfang-Biosensoren geladen. Die Assoziation wurde mit S1 (links) oder S1(D614G) (rechts) durchgeführt, gefolgt von der Dissoziation. Die Daten repräsentieren drei biologische Replikate. b: Die Bindung von Polyhistidin- oder Fc-markiertem S1 an BHK-hACE2-Zellen wird als durchflusszytometrisch nachgewiesene Fluoreszenzpeaks angezeigt. c, Replikationskinetik rekombinanter Viren in Vero-E6-Zellen bei 37 °C (links) und menschlichen Nasenepithelzellen bei 33 °C (rechts). Der Überstand wurde zu den angegebenen Zeitpunkten gesammelt und mittels Plaque-Assay titriert. D614, SARS-CoV-2D614; G614, SARS-CoV-2G614. d, Replikationskinetik rekombinanter Viren in menschlichen NBE-Zellen bei 33 °C (links), 37 °C (Mitte) und 39 °C (rechts). Der Überstand wurde täglich gesammelt und mittels TCID50-Assay titriert. In c, d sind die Daten Mittelwerte ± Standardabweichung von drei biologischen Replikaten (Vero E6-Zellen) oder vier technischen Replikaten (menschliche Nasenepithel- und menschliche NBE-Zellen). Die statistische Signifikanz wurde durch einen zweiseitigen, ungepaarten Student-T-Test ohne Anpassungen für mehrere Vergleiche bestimmt. e, f, Konkurrenzassay rekombinanter Viren in menschlichen Nasenepithelzellen bei 33 °C (e) und menschlichen NBE-Zellen bei 33 °C (f, links), 37 °C (f, Mitte) und 39 °C (f, Rechts). Das Inokulum (ino.) wurde durch Mischen zweier Viren hergestellt und zur Infektion von menschlichem Nasenepithel verwendet (1:1 (e, links), 1:10 (e, Mitte) und 10:1 (e, rechts) PFU-Verhältnisse). (jeweils 8 technische Replikate) und menschliche NBE-Zellen (1:1 PFU-Verhältnis, jeweils 4 technische Replikate). Apikalwaschflüssigkeit und Überstand wurden täglich gesammelt und extrahierte RNA wurde für NGS verwendet. Balkendiagramme zeigen den Prozentsatz der Sequenzlesevorgänge mit der Codierung S oder S(D614G). In Konkurrenzexperimenten an menschlichen Nasenepithel- und menschlichen NBE-Zellen stellt jedes Quadrat einen einzelnen Datenpunkt dar. Für jeden Zeitpunkt wurde ein lineares Regressionsmodell auf der Grundlage der Sequenzierungslesezahlen für S und S(D614G) erstellt und P-Werte für den Gruppenkoeffizienten (Variantenkoeffizienten) berechnet. NS, nicht signifikant (P > 0,05).

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Um die Wirkung von S(D614G) im Zusammenhang mit einer Virusinfektion zu bewerten, haben wir mithilfe eines SARS-CoV-2-Reverse-Genetik-Systems ein isogenes SARS-CoV-2D614- und SARS-CoV-2G614-Paar erzeugt10. Der auf dem Wuhan-Hu-1-Isolat basierende molekulare Klon ist repräsentativ für SARS-CoV-2D614 (Ref. 10,11). Die Sequenz des isogenen SARS-CoV-2G614 wurde mit einem A-zu-G-Übergang an Position 23.403 manipuliert, um ein Glycin an Position 614 von S zu kodieren. Die Identität des resultierenden rekombinanten SARS-CoV-2G614 wurde durch genomische Next-Gen bestätigt. Generationssequenzierung (NGS) des Virusstamms (Passage 1), der in nachfolgenden Experimenten verwendet wird. Die Replikationskinetik von SARS-CoV-2D614 und SARS-CoV-2G614 in Vero-E6-Zellen unterschied sich nur geringfügig (Abb. 1c). Wir untersuchten die Replikationskinetik in primären humanen Nasenepithel- und primären normalen humanen Bronchialepithelzellkulturen (human NBE), die unter Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenbedingungen gezüchtet wurden, die der pseudostratifizierten Epithelauskleidung des menschlichen Atemwegsepithels ähneln. Wir beobachteten keinen signifikanten Unterschied in den primären menschlichen Nasenepithelzellen nach einer Infektion mit SARS-CoV-2D614 oder SARS-CoV-2G614 bei 33 °C (der Temperatur des Nasenepithels) (Abb. 1c). Im Gegensatz dazu zeigte SARS-CoV-2G614 erhöhte Titer in menschlichen NBE-Zellen bei 33 °C, 37 °C und 39 °C, die die Temperaturen der oberen Atemwege, der unteren Atemwege bzw. des Fiebers imitieren (Abb. 1d). . Die Infektionskinetik menschlicher NBE-Zellen mit den natürlichen Isolaten SARS-CoV-2/USA-WA1/2020 (SARS-CoV-2D614) oder SARS-CoV-2/Massachusetts/VPT1/2020 (SARS-CoV-2G614) zeigte ein weiteres subtiler Vorteil für SARS-CoV-2G614 bei 37 °C und 39 °C (Extended Data Abb. 1c). Um diese Analyse zu verfeinern, führten wir Konkurrenzexperimente durch, indem wir menschliche Nasenepithel- und menschliche NBE-Zellkulturen mit einer Mischung aus isogenem SARS-CoV-2D614 und SARS-CoV-2G614 in definierten Verhältnissen infizierten. In beiden primären Zellkultursystemen der menschlichen Atemwege verschob sich das Verhältnis von SARS-CoV-2G614 zu SARS-CoV-2D614 über fünf oder acht Tage der Infektion hinweg zugunsten von SARS-CoV-2G614 (Abb. 1e, f, Erweiterte Daten). Abb. 1d, e, 2a, b). Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass die D614G-Substitution in S mit einer verstärkten hACE2-Bindung und einer erhöhten Replikation in primären menschlichen Atemwegsepithelzellmodellen einer SARS-CoV-2-Infektion verbunden ist.

Mäuse unterstützen die effiziente Replikation von SARS-CoV-2 nicht, es sei denn, sie sind gentechnisch so verändert, dass sie hACE212,13 exprimieren. Um die relative Fitness von SARS-CoV-2G614 in vivo zu bewerten, haben wir Knock-in-Mäuse erzeugt, die menschliches ACE2 unter den endogenen regulatorischen Elementen von Maus-Ace2 exprimieren (Extended Data Abb. 3a). Wir haben acht heterozygote weibliche Mäuse in einem Konkurrenzexperiment intranasal mit einer gleichen Mischung beider Viren (SARS-CoV-2D614 und SARS-CoV-2G614) geimpft, indem wir 1 × 105 Plaque-bildende Einheiten (PFU) jeder Variante gepoolt haben (Abb. 2a). Wir überwachten täglich die virale RNA-Last in oropharyngealen Abstrichen und in verschiedenen Geweben (an den Tagen 2 und 4 nach der Inokulation) mittels Echtzeit-PCR. Bis zum 4. Tag nach der Inokulation konnten wir bei hACE2-Knock-in-Mäusen keinen signifikanten Körpergewichtsverlust beobachten (Extended Data Abb. 3b). Unsere Längsschnittanalyse von oropharyngealen Abstrichen ergab eine effiziente Virusreplikation in den oberen Atemwegen von hACE2-Knock-in-Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen (Abb. 2b). Dementsprechend zeigten Gewebeproben, die an den Tagen 2 und 4 nach der Inokulation entnommen wurden, eine hohe Viruslast in den Nasenmuscheln, der Lunge und den Riechkolben sowie niedrigere Werte im Gehirn (Extended Data Abb. 3c, d). Die Konzentrationen viraler RNA waren in Milz, Dünndarm, Nieren und Kot gering bis nicht nachweisbar (Daten nicht gezeigt). An den Tagen 2 und 4 nach der Inokulation fanden wir keine offensichtlichen pathologischen Läsionen in der Lunge (Ergänzungstabelle 3, 4). NGS der oropharyngealen Abstriche ergaben bei den meisten Mäusen und zu den meisten Zeitpunkten einen Nettovorteil für SARS-CoV-2G614 gegenüber SARS-CoV-2D614 (Abb. 2c, erweiterte Daten Abb. 3e, f). Einen ähnlichen Replikationsvorteil fanden wir für SARS-CoV-2G614 in den Organen (Abb. 2d). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse eine erhöhte Replikation von SARS-CoV-2G614 in einem Mausmodell, das authentisches menschliches ACE2 exprimiert.

a, Versuchsschema für die intranasale Infektion von hACE2-Knock-in-Mäusen mit rekombinantem SARS-CoV-2D614 und SARS-CoV-2G614. Oropharyngeale Abstriche wurden täglich entnommen und Gewebeproben in Untergruppen von 4 Mäusen 2 und 4 Tage nach der Infektion in 2 unabhängigen Experimenten analysiert. b: Quantitative PCR mit Reverse-Transkriptions-Analyse (RT-qPCR) von oropharyngealen Abstrichen von inokulierten hACE2-Knock-in-Mäusen (KI) und Wildtyp-Mäusen. c, d, Kreisdiagramm der mittleren Häufigkeiten des A- oder G-Nukleotids an Position 23.403 (entsprechend D (in Blau) bzw. G (in Orange) an Aminosäureposition 614). K1 bis K8 bezeichnen einzelne Mäuse. Jedes Kreisdiagramm veranschaulicht das Verhältnis von A/G, das in einzelnen oropharyngealen Abstrichproben (c) und Geweben (d) zum angegebenen Zeitpunkt nach der Infektion nachgewiesen wurde. ND, nicht erkannt.

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Hamster sind sehr anfällig für eine SARS-CoV-2-Infektion und entwickeln eine Krankheit, die dem panrespiratorischen, mittelschweren bis schweren COVID-19 beim Menschen sehr ähnelt14,15,16. Um die Replikationskinetik der SARS-CoV-2-Varianten anhand eines Hamstermodells zu untersuchen, haben wir sieben Hamster intranasal mit SARS-CoV-2D614 oder SARS-CoV-2G614 (1 × 105,1 Gewebekultur-Infektionsdosis (TCID50) pro Hamster) geimpft 104,5 TCID50 pro Hamster, berechnet aus der Rücktitration des Inokulums) und überwachten sie an vier aufeinanderfolgenden Tagen. Wir konnten zwischen den beiden Gruppen in der akuten Phase keine deutlichen Unterschiede im Körpergewicht, den Titern des ausgeschiedenen Virus oder der Viruslast im Atemwegsgewebe beobachten (Extended Data Abb. 4c – e). Bei beiden Varianten wurden die höchsten Genomlasten in den Nasenmuscheln gefunden, gefolgt vom Lungengewebe (Extended Data Abb. 4e). Diese Beobachtungen legen nahe, dass die D614G-Substitution in S keinen starken Einfluss auf die klinischen Ergebnisse oder einen nachweisbaren Replikationsvorteil bei Infektionen mit SARS-CoV-2D614 gegenüber SARS-CoV-2G614 im Hamstermodell hat.

Wir haben daher ein In-vivo-Kompetitionsexperiment durchgeführt, um die möglichen Replikations- und/oder Übertragungsunterschiede zwischen den Varianten besser zu klären. Wir inokulierten sechs syrische Spenderhamster intranasal mit einer 1:1-Mischung (auf der Grundlage des infektiösen PFU-Titers) von SARS-CoV-2D614 und SARS-CoV-2G614 in direkten „Eins-zu-eins“-Übertragungsexperimenten. Später bestätigten wir das RNA-Verhältnis der beiden Varianten innerhalb des Inokulums mittels NGS und die absolute Quantifizierung mittels Digital-Droplet-PCR mit allelspezifischen fixierten Nukleinsäuresonden (Abb. 3). 24 Stunden nach der Inokulation wurde jeder geimpfte Hamster zusammen mit einem unbehandelten Hamster gehalten. Die virale RNA-Belastung bei täglichen Nasenspülungen, Veränderungen des Körpergewichts und klinische Symptome stimmten alle mit zuvor veröffentlichten Daten überein14,15,16 (Erweiterte Daten Abb. 4a, b). NGS der viralen RNA-Sequenzzusammensetzung von Nasenspülungen zeigten eine deutliche Verschiebung in Richtung SARS-CoV-2G614 innerhalb von 48 Stunden nach der Inokulation (Abb. 3, Erweiterte Daten Abb. 4f, g). Die Übertragungseffizienz betrug 100 % und die Analyse der RNA-Sequenzzusammensetzung zeigte, dass SARS-CoV-2G614 über 90 % der viralen RNA in den Kontakthamstern ausmachte (Abb. 3). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Hamster, die mit einem gleichen Verhältnis von SARS-CoV-2D614 und SARS-CoV-2G614 geimpft wurden, 24 Stunden nach der Impfung hauptsächlich SARS-CoV-2G614 übertragen.

Dargestellt ist die Übertragung von SARS-CoV-2D614 und SARS-CoV-2G614 durch Hamster in einer paarweisen Einzelanordnung mit direktem Kontakt von Spender- und zusammengehaltenen Kontakthamstern. Zwischen Tag 2 und Tag 8 nach der Infektion (dpi) und schließlich 12 Tage nach der Infektion wurden täglich Proben von Nasenspülungen entnommen und anschließend analysiert. Kreisdiagramm des Anteils des A- oder G-Nukleotids an Position 23.403 (entsprechend D bzw. G an Aminosäureposition 614), gemessen durch NGS von Amplifikaten. Genomkopien wurden aus RT-qPCR unter Verwendung eines RNA-Standards berechnet. Die orange Färbung der Hamstersilhouette bezieht sich auf den Nachweis von G (d. h. SARS-CoV-2G614) und die blaue auf den Nachweis von A (d. h. SARS-CoV-2D614) zu den meisten Zeitpunkten. Graue Färbung, keine Infektion festgestellt.

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Wir haben den Wettbewerbsvorteil von S(D614G) bei Frettchen weiter untersucht, die ein gutes Modell für die Übertragung von SARS-CoV-2 darstellen17, bei dem sich das Virus hauptsächlich in den oberen Atemwegen repliziert (ähnlich leichten Infektionen beim Menschen). Wir inokulierten sechs Frettchen intranasal mit einer 1:1-Mischung (auf Basis des infektiösen PFU-Titers) von SARS-CoV-2D614 und SARS-CoV-2G614 in direkten Eins-zu-eins-Übertragungsexperimenten. Bei allen sechs inokulierten Frettchen wurde eine SARS-CoV-2-Infektion bestätigt: Körpergewichtsveränderungen und virale RNA-Lasten in Nasenspülungen (Abb. 4, Erweiterte Daten Abb. 5a, b) stimmten mit zuvor veröffentlichten Daten überein17,18. Bei fünf der sechs geimpften Frettchen wurde SARS-CoV-2G614 zur dominanten Variante (Abb. 4, Erweiterte Daten Abb. 5c, d). Darüber hinaus kam es bei vier der sechs Frettchenpaare zu einer SARS-CoV-2-Übertragung. In jedem Paar mit erfolgreicher Übertragung setzte sich SARS-CoV-2G614 gegen SARS-CoV-2D614 durch (Abb. 4). Alle NGS-Daten der Frettchenproben wurden durch absolute Quantifizierung unter Verwendung allelspezifischer fixierter Nukleinsäuresonden und digitaler Tröpfchen-PCR-Analyse erneut getestet. Bemerkenswert ist, dass das inokulierte Frettchen aus Paar 1 (bei dem SARS-CoV-2D614 die Viruspopulation dominierte) trotz einer hohen Spitzenlast des viralen Genoms von mehr als 10 Millionen Kopien pro ml kein Virus auf den Kontakt übertrug. Im Gegensatz dazu war die fehlende Übertragung in Paar 4 (in dem SARS-CoV-2G614 zur dominanten Variante wurde) mit einer maximalen Viruslast von unter 500.000 Genomkopien pro ml verbunden (Abb. 4). Zusammenfassend ergab das Konkurrenzexperiment an Frettchen, dass SARS-CoV-2G614 fünf von sechs geimpften Frettchen bevorzugt infizierte und replizierte und dass die erfolgreichen Übertragungsereignisse nur bei SARS-CoV-2G614 auftraten.

Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus, bei dem sechs Paare aus je einem Spenderfrettchen und einem naiven Kontaktfrettchen zusammen gehalten wurden. Zwischen Tag 2 und Tag 8 nach der Infektion und schließlich 12 Tage nach der Infektion wurden täglich Proben von Nasenspülungen entnommen und anschließend analysiert. Kreisdiagramm des Bruchteils des A- oder G-Nukleotids an Position 23.403 (entsprechend D bzw. G an Aminosäureposition 614). Jedes Kreisdiagramm veranschaulicht das Verhältnis von A/G, das aus einzelnen Nasenspülproben im Zeitverlauf ermittelt wurde. Die orange Färbung der Frettchensilhouette bezieht sich auf den Nachweis von G (d. h. SARS-CoV-2G614) zu den meisten Zeitpunkten, und die blaue Färbung zeigt den Nachweis von A (d. h. SARS-CoV-2D614) an. Die Zahlen geben die Gesamtzahl der Genomkopien pro ml an. Grau, keine Infektion oder virale Genomzahl zu niedrig, um das A/G-Verhältnis durch NGS zu bestimmen.

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Es wurde angenommen, dass die Entwicklung von SARS-CoV-2 beim Menschen ein nichtdeterministischer Prozess ist, bei dem die Diversifizierung des Virus hauptsächlich auf einer zufälligen genetischen Drift beruht, was darauf hindeutet, dass kein starker Selektionsdruck auf seine Anpassung beim Menschen wirkt19. Seit dem Aufkommen der D614G-Substitution in S Anfang 2020 ist die SARS-CoV-2G614-Variante jedoch weltweit verbreitet1. Sowohl ein Gründereffekt als auch strukturelle Veränderungen von S wurden bereits als treibende Kräfte bei der Feststellung der Prävalenz von SARS-CoV-2G614 vorgeschlagen. Frühere Strukturstudien und die Verwendung pseudotypisierter Viren haben darauf hingewiesen, dass SARS-CoV-2G614 aufgrund einer erhöhten „offenen“ Konformation der Rezeptorbindungsdomäne für die Rezeptorbindung oder einer erhöhten S-Stabilität eine erhöhte Infektiosität verleihen kann1,9. Im Gegensatz zu diesen Studien (die rekombinantes trimeres S verwendeten) verwendeten wir einen reduktionistischen Ansatz, um Komplikationen aufgrund von „offenen“ oder „geschlossenen“ Konformationen der Rezeptorbindungsdomäne in trimerem S zu beseitigen. Wir fanden, dass S1(D614G) oder Monomer S(D614G) hatte beide eine erhöhte Affinität zu hACE2, was ein weiterer Mechanismus sein könnte, der der erhöhten Replikation und Übertragung von SARS-CoV-2G614 zugrunde liegt.

Kürzlich wurde über Studien mit isogenem SARS-CoV-2D614 und SARS-CoV-2G614 zur Beurteilung des Phänotyps im Zusammenhang mit einer SARS-CoV-2-Infektion berichtet20,21. Beide Studien haben gezeigt, dass SARS-CoV-2G614 die Replikation in vitro steigerte, und eine21 beobachtete eine frühere Übertragung in einem Hamstermodell. Wir haben diese Studien erweitert, indem wir eine Reihe von In-vitro- und In-vivo-Modellen der SARS-CoV-2-Infektion genutzt haben: primäre menschliche Nasenepithel- und menschliche NBE-Zellkulturen, ein hACE2-Knock-in-Mausmodell, ein Hamstermodell und ein Frettchenmodell. In diesen experimentellen Systemen beobachteten wir durchweg eine erhöhte Replikationsfitness von SARS-CoV-2G614 gegenüber SARS-CoV-2D614, indem wir NGS-Techniken und eine allelspezifische absolute Quantifizierung zur Bestätigung anwendeten. Der Vorteil, der durch die D614G-Substitution in S entsteht, war in Konkurrenz- und Übertragungsexperimenten an Hamstern und Frettchen am deutlichsten und muss daher als treibende Kraft angesehen werden, die zur weltweiten Dominanz von SARS-CoV-2G614 geführt hat.

Unsere Daten stimmen auch mit zuvor gemeldeten funktionellen Veränderungen überein, die durch die D614G-Substitution in S1 verursacht werden, und mit der zuvor berichteten erhöhten Infektiosität pseudotypisierter Viren, die diese Substitution enthalten9,22. Obwohl unsere Studien einen Phänotyp der erhöhten Replikation und Übertragung von SARS-CoV-2G614 belegen, gibt es in keinem der von uns verwendeten Tiermodelle Hinweise auf eine Veränderung der Pathogenität. Dies ist wichtig, da eine Infektion mit SARS-CoV-2G614 nicht mit der Entwicklung einer schweren COVID-19-Erkrankung beim Menschen verbunden ist1.

Die anhaltende Pandemie wird wahrscheinlich zu weiteren Varianten von SARS-CoV-2 führen, die phänotypische Veränderungen und weitere Anpassungen an menschliche oder tierische (z. B. Nerze) Reservoirs aufweisen können. Die Fähigkeit, neu auftretende Varianten mithilfe der Genomik schnell zu identifizieren, neu auftretende Virusvarianten zu rekonstruieren und ihre Phänotypen in vitro und in vivo zu bewerten, wird eine schnelle Reaktion auf ihr Auftreten mit geeigneten Gegenmaßnahmen ermöglichen. Das in diesem Artikel beschriebene Mausmodell, das auf der hACE2-Expression unter den endogenen regulatorischen Elementen von Maus-Ace2 basiert, ist ein wertvolles Werkzeug und wird bestehende Tiermodelle der SARS-CoV-2-Infektion ergänzen. Ähnlich wie unser hier gezeigter Nachweis der erhöhten Replikation und Übertragbarkeit von SARS-CoV-2G614 wird die phänotypische Bewertung künftiger Varianten wahrscheinlich mehrere komplementäre Tiermodelle erfordern, die zusammen Aspekte der Replikation, Übertragung und Pathogenität von SARS-CoV-2 beim Menschen widerspiegeln.

Zur Bestimmung der Stichprobengröße wurden keine statistischen Methoden verwendet. Die Experimente waren nicht randomisiert und die Forscher waren nicht blind gegenüber der Zuordnung während der Experimente und der Ergebnisbewertung, sofern nicht anders angegeben.

Vero E6-Zellen (ein Geschenk von M, Müller) wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 1x nicht-essentiellen Aminosäuren, 100 Einheiten ml Penicillin und 100 μg ml Streptomycin, kultiviert . Babyhamster-Nierenzellen (BHK), die SARS-CoV-Nukleoprotein (N)23,24 exprimieren, wurden in minimalem essentiellen Medium (MEM) gehalten, ergänzt mit 5 % fötalem Rinderserum (FBS), 1x nicht-essentiellen Aminosäuren, 100 Einheiten ml– 1 Penicillin und 100 μg ml-1 Streptomycin, 500 μg ml-1 G418 und 10 μg ml-1 Puromycin. Vierundzwanzig Stunden vor der Elektroporation wurden die BHK-Zellen, die SARS-CoV N exprimierten, mit 1 μg ml−1 Doxycyclin behandelt, um das SARS-CoV N-Protein zu exprimieren. Alle Zelllinien wurden bei 37 °C und in einer 5 % CO2-Atmosphäre gehalten.

Das Expi293-Expressionssystem (ThermoFisher Scientific) wurde zur Herstellung von hACE2 und S verwendet. Expressionsplasmide für Säugetiere wurden konstruiert, um codonoptimiertes Fc(humanes IgG1)-markiertes hACE2 (hACE2–Fc) oder Polyhistidin-markiertes S (S und S(D614G) zu kodieren )), die die Ektodomäne von S in voller Länge enthalten (Reste 1–1208, mit einer mutierten Furin-Spaltungsstelle und K986P/V987P-Substitutionen). Expi293F-Zellen wurden mit den Plasmiden transfiziert und bei 37 °C mit 8 % CO2 und einer Schüttelgeschwindigkeit von 125 U/min kultiviert. Der Überstand wurde am 5. Tag durch 20-minütige Zentrifugation bei 3.000 g und 4 °C gesammelt. Das hACE2-Fc-Protein wurde unter Verwendung einer HiTrap Protein A-Säule (GE Life Sciences) in Elutionspuffer mit 0,1 M Zitronensäure, pH 3,0, gereinigt. S wurde unter Verwendung einer HisTrap FF-Säule (GE Life Sciences) in Elutionspuffer gereinigt, der 20 mM Natriumphosphat, 0,5 M NaCl und 500 mM Imidazol, pH 7,4, enthielt. Die Eluenten wurden unter Verwendung einer Zeba-Spin-Entsalzungssäule mit 7K MWCO (Thermo Fisher Scientific) entsalzt. Die gereinigten Proteine ​​wurden weiter auf Amicon Ultra Centrifugal Filters 50K NMWL (Sigma-Aldrich) konzentriert und mithilfe des Qubit-Proteinassays (ThermoFisher Scientific) quantifiziert.

Die Affinität zwischen hACE2–Fc und S1 (ABclonal, RP01262), S1(D614G) (ABclonal, RP01287), S oder S(D614G) wurde mit dem Octet RED96-Instrument (ForteBio) bei 30 °C und einer Schüttelgeschwindigkeit von 1.000 U/min bewertet. Nach 20-minütiger Vorhydratisierung der Anti-Human-Fc-Einfang-Biosensoren und 1-minütiger Sensorprüfung wurden 7,5 nM hACE2-Fc in 10-fachem kinetischem Puffer (ForteBio) 5 Minuten lang auf die Oberfläche der Biosensoren geladen. Nach 1,5 Minuten Grundlinienäquilibrierung wurde eine 5-minütige Assoziation mit 25 bis 200 nM S1 oder S1(D614G) oder mit 10–100 nM S oder S(D614G) durchgeführt, gefolgt von einer 5-minütigen Dissoziation im gleichen Puffer Wird für den Grundlinienausgleich verwendet. Die Daten wurden durch Subtrahieren der Referenzprobe korrigiert; Zur Bestimmung der Affinitätskonstanten wurde ein 1:1-Bindungsmodell mit globaler Anpassung verwendet.

Ein stabiler Klon von BHK-hACE2-Zellen wurde pelletiert und in Reaktionspuffer (PBS pH 7,4 mit 0,02 % Tween-20 und 4 % BSA) in einer Konzentration von 5 × 106 Zellen pro ml resuspendiert. Einhundert Mikroliter pro Vertiefung der Zellen wurden in eine Platte mit rundem Boden und 96 Vertiefungen aufgeteilt und mindestens 5 Minuten lang auf Eis inkubiert. Polyhistidin-markierte S1- (40591-V08H) und S1(D614G) (40591-V08H3) und Fc-markierte S1- (40591-v02H) und S1(D614G)-Proteine ​​(40591-v02H3) wurden von Sino Biological gekauft und in der Reaktion verdünnt Puffer auf Eis. Fünfzig Mikroliter S1-Verdünnungsmittel wurden in die entsprechenden Zellvertiefungen gegeben und 20 Minuten lang unter Schütteln auf Eis inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen einmal in 200 μl PBST-Waschlösung (PBS pH 7,4 mit 0,02 % Tween-20) und dann mit 100 μl 1:300 verdünntem Sekundärantikörper (ThermoFisher Kat.-Nr. A-21091 für den Fc-Tag) gewaschen und ThermoFisher-Kat.-Nr. MA1-21315-647 für den Polyhistidin-Tag) wurde in jede Zellvertiefung gegeben, gemischt und 15 Minuten lang unter Schütteln auf Eis inkubiert. Nach zweimaligem Waschen wurden die Zellen in 200 μl PBST resuspendiert und mit einem BD FACSCanto II-Durchflusszytometer analysiert. Die Daten wurden mit Flowjo v.10.6.1 verarbeitet. Die Ergebnisse für BHK-Kontrollzellen (die kein hACE2 exprimieren) und die Gating-Strategie sind in den ergänzenden Abbildungen dargestellt. 1, 2.

Um die Mutation für die D614G-Substitution in das S-Gen einzuführen, wurde eine PCR-Mutagenese (Ergänzungstabelle 1) am pUC57-Plasmid mit dem SARS-CoV-2-Fragment 1010 unter Verwendung eines Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit (New England BioLab) durchgeführt. Sowohl S- als auch SD614G-infektiöse cDNA-Klone wurden mithilfe der in der Hefetransformation assoziierten Rekombinationsklonierungsmethode wie zuvor beschrieben10 erzeugt. Die In-vitro-Transkription wurde für EagI-gespaltenes YAC und PCR-amplifiziertes SARS-CoV-2-N-Gen unter Verwendung des T7 RiboMAX Large Scale RNA-Produktionssystems (Promega) wie zuvor beschrieben4 durchgeführt. Transkribierte capped mRNA wurde in Nierenzellen von Babyhamstern (BHK-21-Zellen) elektroporiert, die das SARS-CoV-N-Protein exprimierten. Elektroporierte Zellen wurden mit anfälligen Vero E6-Zellen kokultiviert, um Passage 0 von rekombinantem SARS-CoV-2D614 und SARS-CoV-2G614 zu produzieren. Anschließend wurden Nachkommenviren verwendet, um frische Vero-E6-Zellen zu infizieren, um Passage-1-Bestände für nachfolgende Experimente zu erzeugen.

Die Charakterisierung der Viruswachstumskinetik in Vero E6 wurde wie zuvor beschrieben10 durchgeführt. Vierundzwanzig Stunden vor der Infektion wurden die Zellen in einer Platte mit 24 Vertiefungen in einer Dichte von 2,0 × 105 Zellen pro ml ausgesät. Nach einmaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen mit Viren bei einer Infektionsmultiplizität von 0,01 beimpft. Nach 1 Stunde wurde das Inokulum entfernt und die Zellen dreimal mit PBS gewaschen, gefolgt von der Versorgung mit geeignetem Kulturmedium.

PFUs pro ml rekombinantes SARS-CoV-2D614 und SARS-CoV-2G614 wurden durch Plaque-Assay in einem 24-Well-Format bestimmt. Einen Tag vor der Infektion wurden Vero-E6-Zellen in einer Dichte von 2,0 × 105 Zellen pro ml ausgesät. Nach einmaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen mit Viren inokuliert, die seriell in Zellkulturmedium in einer Verdünnung von 1:10 verdünnt wurden. Nach einer Stunde Inkubation wurde das Inokulum entfernt und die Zellen mit PBS gewaschen und anschließend mit einer 1:1-Mischung aus 2,4 % Avicel und 2 × DMEM, ergänzt mit 20 % fötalem Rinderserum, 200 Einheiten ml Penicillin und 200 μg ml, überschichtet −1 Streptomycin. Nach 2-tägiger Inkubation bei 37 °C wurden die Zellen in 4 % (v/v) neutral gepuffertem Formalin fixiert, bevor sie mit Kristallviolett angefärbt wurden.

Die statistische Signifikanz wurde durch einen zweiseitigen, ungepaarten Student-T-Test ohne Anpassung für mehrere Vergleiche bestimmt.

Primäre menschliche Nasenepithelzellkulturen (MucilAir EP02, Epithelix Sàrl) wurden gekauft und gemäß den Anweisungen des Herstellers gehandhabt. Menschliche NBE-Zellen wurden gekauft (von der Emory University) und gemäß den empfohlenen Protokollen kultiviert. Die menschlichen Nasenepithelkulturen wurden mit 0,5 × 105 PFU pro Vertiefung oder Mischungen von 1:1, 10:1 und 1:10 von SARS-CoV-2D614 und SARS-CoV-2G614 beimpft. Menschliche NBE-Zellkulturen wurden mit 1,0 × 105 PFU pro Vertiefung oder mit den Wildtyp-Isolaten SARS-CoV-2/USA-WA1/2020 (SARS-CoV-2D614) oder SARS-CoV-2/Massachusetts/VPT1/ beimpft. 2020 (SARS-CoV-2G614), bei 2 × 105 TCID50 pro Well. Für Konkurrenzexperimente wurden menschliche NBE-Zellen mit 1:1 oder 9:1 gemischten SARS-CoV-2D614 und SARS-CoV-2G614 mit 1 × 105 PFU pro Vertiefung inokuliert. Nach ein- bzw. zweistündiger Inkubation bei 33 °C wurde das Inokulum für menschliche Nasenepithel- bzw. menschliche NBE-Zellkulturen entfernt (oder für menschliches NBE als 2-Stunden-Proben gesammelt), die Zellen wurden gewaschen und anschließend inkubiert (wie angegeben). ) bei 33 °C, 37 °C oder 39 °C. Um die Virusreplikation zu überwachen, wurden alle 24 Stunden apikale Waschflüssigkeiten gesammelt. Alle Titer wurden durch Standard-Plaque-Assay oder TCID50 an Vero-E6-Zellen bestimmt.

Für Konkurrenzexperimente wurde virale RNA aus apikalen Waschungen mit dem QIAamp 96 Virus QIAcube HT Kit (QIAGEN) extrahiert. Das SARS-CoV-2-Genom wurde mithilfe einer hochmultiplexierten Tiling-PCR-Reaktion basierend auf dem Artic Network-Protokoll (https://www.protocols.io/view/ncov-2019-sequencing-protocol-bbmuik6w) mit einigen Modifikationen amplifiziert. Kurz gesagt, Primer wurden entwickelt, um überlappende 1-kb-Amplifikate zu erzeugen (Ergänzungstabelle 1). Reverse Transkriptase wurde wie im Artic Network-Protokoll beschrieben durchgeführt. Die einzelne cDNA-Reaktion wurde durch die Vorbereitung zweier PCR-Reaktionen (jeweils eine für den ungeraden und den geraden Primerpool) fortgesetzt. Es wurden zwei Primerpools (ungerade und gerade) vorbereitet, die 0,1 μM jedes einzelnen Primers enthielten. Die Tiling-PCR der resultierenden cDNA wurde durch Kombinieren von 12,5 μl 2× Q5-Polymerase, 5,5 μl Wasser, 2 μl des Primerpools und 5 μl cDNA durchgeführt, gefolgt von einer Inkubation der Reaktion bei 98 °C für 30 s, 38 Zyklen bei 98 °C C für 15 s und 63 °C für 5 min und Halten bei 4 °C. Entsprechende ungerade und gerade Amplikons wurden normalisiert und zur Bibliotheksvorbereitung gepoolt. Fragmentierte Bibliotheken wurden mit dem DNA-Bibliotheksvorbereitungskit Nextera XT vorbereitet und mit Illumina MiSeq sequenziert. Die Analysen wurden mit IRMA25 mit einem SARS-CoV-2-Modul durchgeführt.

Die Vorbereitung der viralen RNA für NGS erfolgte wie zuvor beschrieben10. Kurz gesagt, Vero E6-Zellen wurden mit Passage-1-Viren infiziert. Die Extraktion der gesamten zellulären RNA erfolgte mit dem Nucleospin RNA Plus Kit (Macherey-Nagel) gemäß den Anweisungen des Herstellers.

RNA aus apikalen Waschungen menschlicher Nasenepithelzellen und oropharyngealer Abstriche von Mäusen wurde mit dem QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN) und dem Nucleospin RNA Kit (Macherey-Nagel) gemäß den Protokollen des Herstellers hergestellt.

Um die Verhältnisse von SARS-CoV-2D614 zu SARS-CoV-2G614 in Konkurrenztests in menschlichen Nasenepithelzellkulturen und hACE2-Knock-in-Mäusen zu bestimmen, wurde eine Reverse-Transkriptions-PCR an extrahierter RNA mit SuperScript IV One-step RT-PCR durchgeführt System (Invitrogen). Die sequenzspezifischen Primer wurden verwendet, um ein Amplikon von 905 bp zu erzeugen, das die D614-Region abdeckt: 5'-AATCTATCAGGCCGGTAGCAC-3' und 5'-CAACAGCTATTCCAGTTAAAGCAC-3'. Die RT-PCR-Reaktion wurde in einer 50-μl-Reaktion mit 0,01 pg bis 1 μg Gesamt-RNA durchgeführt. Die Zyklusparameter wurden wie folgt eingestellt: 50 °C für 10 Minuten, 98 °C für 2 Minuten; 35 Zyklen bei 98 °C für 10 s, 55 °C für 15 s und 72 °C für 30 s; und eine 5-minütige Inkubation bei 72 °C. Die DNA-Konzentration wurde mit dem Qubit dsDNA HS-Assay (High Sensitivity) (Thermo Fisher) bestimmt und anschließend zur Sequenzierung durch Nanopore-Sequenzierung MinION auf 200 ng in 50 μl nukleasefreiem Wasser verdünnt.

Die RNA-Extraktion und die Vorbereitung der RT-PCR-Reaktionen wurden in einer Laborumgebung mit wenig und ohne Kopien durchgeführt, um Kontaminationen zu vermeiden.

Rekombinante SARS-CoV-2D614- oder SARS-CoV-2G614-RNAs aus Passage-1-Stamm wurden durch NGS wie zuvor beschrieben sequenziert10. Kurz gesagt, RNA wurde aus Vero-E6-Zellen extrahiert, die entweder mit rekombinantem SARS-CoV-2D614 oder SARS-CoV-2G614 infiziert waren, unter Verwendung des NucleoSpin RNA Plus-Kits (Macherey-Nagel) gemäß den Richtlinien des Herstellers. Anschließend wurden Sequenzierungsbibliotheken mit dem Illumina TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit (Illumina, 20020595) erstellt und gepoolte cDNA-Bibliotheken wurden über zwei Spuren auf einer NovaSeq 6000 S1-Durchflusszelle (2 × 50 bp, 100 Zyklen) unter Verwendung der Illumina NovaSeq 6000-Plattform sequenziert (Next Generation Sequencing Platform der Universität Bern). Für die Datenanalyse wurde TrimGalore v.0.6.5 verwendet, um Lesevorgänge und Adapter mit geringer Qualität aus den Rohsequenzierungsdateien zu entfernen. Die resultierenden gekürzten Paired-End-Reads wurden dann mithilfe von Bowtie2 v.2.3.5 mit dem SARS-CoV-2-Genom (GenBank-Zugang MT108784) abgeglichen. Schließlich wurde mit Samtools v.1.10 eine Konsenssequenz für jeden Virenbestand generiert, wobei die Option -d auf 10.000 gesetzt war. Die Datenanalyse wurde auf UBELIX, dem Hochleistungsrechnercluster der Universität Bern (http://www.id.unibe.ch/hpc), durchgeführt.

Für Viruskompetitionsexperimente in menschlichen Nasenepithelzellen, hACE2-Knock-in-Mäusen, Hamstern und Frettchen wurden Amplifikate auf dem MinION-System von Oxford Nanopore sequenziert. Mit MinKnow v.20.06.17 und Guppy v.s4.0.11 wurden hochpräzise Basisaufrufe in Echtzeit, Demultiplexen sowie Barcode- und Adapter-Trimmen durchgeführt. Die Downstream-Analyse wurde in Geneious 2019 v.s2.3 durchgeführt. Die Leselänge wurde gefiltert, um Lesevorgänge <800 und >1.100 nt zu eliminieren, und die verbleibenden Lesevorgänge wurden in Teilmengen von 10.000 Lesevorgängen der Amplikonreferenz zugeordnet, die zwei Iterationen durchlief, wobei die benutzerdefinierte Empfindlichkeit maximal 5 % Lücken und eine maximale Nichtübereinstimmung von 30 % zuließ. Varianten wurden an bestimmten Positionen analysiert und P-Werte für jede Variante berechnet. Das Verhältnis Bruchteil A/G wurde aus der Anzahl der Lesevorgänge berechnet, als Bruchteil = A-Lesevorgänge/(A-Lesevorgänge + G-Lesevorgänge).

Statistische Analysen für Viruskompetitionsexperimente und Berechnungen der relativen replikativen Fitness wurden mit dem Catseyes-Paket in R durchgeführt. Die relativen replikativen Fitnesswerte für SARS-CoV-2G614 gegenüber SARS-CoV-2D614 wurden durch Division der anfänglichen Werte für SARS-CoV-2G614/SARS-CoV-2G614 ermittelt. CoV-2D614-Verhältnis (i0) durch das endgültige (nach der Infektion) SARS-CoV-2G614/SARS-CoV-2D614-Verhältnis (f0) gemäß der Formel w = (f0/i0). Um f0/i0 in jedem Experiment zu modellieren, wurde das t1/t0-Verhältnis insbesondere auf der Grundlage der Sequenzierungszahlen berechnet, die für jedes Virus in einzelnen Proben (nach der Infektion, Zeitpunkt t1) und im Inokulum (anfänglicher Zeitpunkt t0) erzielt wurden. . Für jeden Zeitpunkt wurde ein lineares Regressionsmodell in R erstellt und die Fitnessverhältnisse zwischen den beiden Gruppen (Varianten) anhand des Koeffizienten des Gruppenterms des Modells bewertet. Wenn mehrere Experimente durchgeführt wurden, wurde die Experimentvariable in das Modell einbezogen. Alle statistischen Tests wurden in R (v.4.0.2) mit zweiseitigem α = 0,05 durchgeführt. Katzenaugendiagramme, die die relative Replikationsfitness von SARS-CoV-2G614 gegenüber SARS-CoV-2D614 für jeden Zeitpunkt in jedem Experiment zeigen, wurden mit dem Catseyes-Paket in R26 erstellt, wie zuvor beschrieben20.

Die hACE2-Knock-in-Mäuse wurden ursprünglich am Wadsworth Center des New York State Department of Health (IACUC-Protokoll Nr. 09-405) (Hauptforscher DEW) erzeugt. Mausversuche wurden im Einklang mit der Schweizer Tierschutzgesetzgebung durchgeführt und Tierversuche wurden von der Kommission für Tierversuche des Kantons Bern unter der Lizenz BE-43/20 geprüft und genehmigt. Alle Frettchen- und Hamsterversuche wurden von der zuständigen Ethikkommission des Landesamtes für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommerns (LALLF MV) ausgewertet und erhielten die staatliche Genehmigung unter der Registrierungsnummer LVL MV TSD/7221.3-1 -041/20. Dieses Projekt erhielt auch die Genehmigung des Animal Care and Use Program Office des CDC.

Für die Erzeugung von hACE2-Knock-in-Mäusen wurde die hACE2-Knock-in-Linie (B6) (B6.Cg-Ace2tm1(ACE2)Dwnt/J) durch gezielte Mutagenese erzeugt, um menschliche ACE2-cDNA anstelle des Maus-Ace2-Gens zu exprimieren. Somit wird in diesem Mausmodell die hACE2-Expression durch die endogenen Maus-Ace2-Promotor- und Enhancer-Elemente reguliert. Der Targeting-Vektor (WEN1-HR) enthielt menschliche ACE2-cDNA im Rahmen mit dem endogenen Initiationscodon des Maus-Ace2 (Extended Data, Abb. 3a). Die menschliche cDNA wurde von einer FRT-Neomycin-FRT-loxP-Kassette und einer distalen loxP-Stelle flankiert. WEN1-HR wurde zur Transfektion embryonaler 129Sv/Pas-Stammzellen verwendet und 837 embryonale Stammzellklone wurden isoliert und mittels PCR und Southern Blot auf homologe Rekombination gescreent. Elf ordnungsgemäß rekombinierte embryonale Stammzellklone wurden identifiziert und einige von ihnen wurden zur Blastozysteninjektion und -implantation in weibliche Mäuse verwendet, um 22 männliche Gründermäuse mit einem Chimärismus (129Sv/Pas:C57BL/6) im Bereich von 50 bis 100 % zu erzeugen. Um den hACE2-Knock-in zu vervollständigen, kreuzten wir die chimären männlichen Mäuse mit C57BL/6J Flp-exprimierenden weiblichen Mäusen, um die FRT-flankierte Neomycin-Selektionskassette herauszuschneiden und das floxierte humanisierte ACE2-Allel zu erzeugen (Extended Data Abb. 3a). Diese hACE2-Knock-in-Mäuse wurden durch PCR identifiziert und durch Southern Blot bestätigt und vor dieser Studie sieben Generationen lang mit C57BL/6J-Mäusen rückgekreuzt. Diese Linie wurde dem Jackson Laboratory zur Nutzung durch die wissenschaftliche Gemeinschaft gespendet (Bestandsnummer 035000).

Heterozygote weibliche hACE2-Knock-in-Mäuse wurden vom Jackson Laboratory erhalten und weibliche C57BL/6J-Wildtyp-Mäuse stammten vom Janvier Lab. Alle Mäuse wurden mindestens 2 Wochen lang in individuell belüfteten Käfigen (blaue Linie, Tecniplast) mit 12-Stunden-/12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus, 22 ± 1 °C Umgebungstemperatur und 50 ± 5 % Luftfeuchtigkeit sowie autoklaviertem, angesäuertem Wasser akklimatisiert , autoklavierte Käfige inklusive Futter, Einstreu und Umgebungsanreicherung in der spezifisch pathogenfreien Einrichtung des Instituts für Virologie und Immunologie (Mittelhäusern). Eine Woche vor der Infektion wurden die Mäuse in einzeln HEPA-gefilterte Isolatoren (IsoCage N, Tecniplast) gegeben. Mäuse (10 bis 12 Wochen alt) wurden mit Isofluran betäubt und intranasal mit 20 μl (also 10 μl pro Nasenloch) im Verhältnis 1:1 der SARS-CoV-2-Varianten (Wildtyp und hACE2-Knock-in) infiziert Mäuse) oder Scheinkulturmedium (nur Wildtyp-Mäuse). Nach einer intranasalen Infektion wurden die Mäuse täglich auf Körpergewichtsverlust und klinische Symptome überwacht. Rachenabstriche wurden täglich unter kurzer Isoflurananästhesie unter Verwendung ultrafeiner steriler Flockentupfer (Hydraflock, Puritan, 25-3318-H) gesammelt. Die Spitzen der Tupfer wurden in 0,5 ml RA1-Lysepuffer (Macherey-Nagel, Ref. 740961), ergänzt mit 1 % β-Mercaptoethanol, gegeben und gevortext. Gruppen von Mäusen aus zwei unabhängigen Experimenten wurden am 2. und 4. Tag nach der Infektion eingeschläfert und die Organe aseptisch präpariert, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Es wurde eine systematische Gewebeentnahme durchgeführt: (1) Der rechte Oberlappen der Lunge, die rechte Nasenmuschel, der rechte Riechkolben, ein Teil der rechten Gehirnhälfte, der apikale Teil der rechten Niere und Teile des distalen Dünndarms (Ileum) wurden zur RNA-Isolierung entnommen in RA1-Lysepuffer; (2) Mittel-, Unter- und Postkavallappen der Lunge, linke Nasenmuschel, linker Riechkolben, ein Teil der rechten Gehirnhälfte und ein Teil der rechten Niere wurden in MEM gesammelt; und (3) der linke Lungenlappen, der linke Leberlappen, die linke Niere, die linke Gehirnhälfte und ein Teil des Jejunums und Ileums wurden in gepuffertem Formalin fixiert. Die Daten wurden aus zwei identisch konzipierten unabhängigen Experimenten generiert.

In RA1-Lysepuffer, ergänzt mit 1 % β-Mercaptoethanol, gesammelte Mausgewebeproben wurden mit einem Bullet Blender Tissue Homogenizer (Next-Advance) homogenisiert. Homogenate wurden 3 Minuten lang bei 18.000 g zentrifugiert und bis zur Verarbeitung bei –70 °C gelagert. Die Gesamt-RNA wurde aus Homogenaten mit dem NucleoMag VET-Kit für virale und bakterielle RNA und DNA aus Veterinärproben (Macherey Nagel, Ref. 744200) und dem automatisierten Extraktionsgerät KingFisher Flex (ThermoFisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die RNA-Reinheit wurde mit einem NanoDrop 2000 (ThermoFisher Scientific) analysiert. Eine 25 μl RT-PCR für das virale E-Gen wurde unter Verwendung von 5 μl extrahierter RNA-Matrize unter Verwendung der AgPath-ID One-Step RT-PCR (Applied Biosystems) durchgeführt. Die Proben wurden doppelt verarbeitet. Amplifikation und Nachweis wurden in einem Applied Biosystem 7500 Real-Time PCR System unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: eine anfängliche reverse Transkription bei 45 °C für 10 Minuten, gefolgt von einer PCR-Aktivierung bei 95 °C für 10 Minuten und 45 Amplifikationszyklen (15 s bei 95 °C, 30 s bei 56 °C und 30 s bei 72 °C).

Fixierte Mausgewebeproben wurden in der COMPATH-Kernanlage (Universität Bern) verarbeitet, geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Histopathologische Lungenschnitte von hACE2-Knock-in-Mäusen und Wildtyp-Mäusen (infiziert und Scheinmäuse) wurden von einem staatlich geprüften Veterinärpathologen (SdB) untersucht und bewertet, der keine Kenntnis von der Identität der Proben hatte. Die Bewertungskriterien sind in der Ergänzungstabelle 4 aufgeführt.

Sechs Syrische Hamster (Mesocricretus auratus) (Janvier Labs) wurden intranasal unter einer kurzfristigen Inhalationsnarkose mit 70 μl SARS-CoV-2D614 und SARS-CoV-2G614 in gleichen Verhältnissen infiziert, wobei 104,77 TCID50 pro Hamster verwendet wurden (berechnet aus der Rücktitration von das Originalmaterial). Nach 24 Stunden isolierter Unterbringung in individuell belüfteten Käfigen wurden sechs Paare (jeweils mit einem direkt inokulierten Spenderhamster und einem scheininokulierten Kontakthamster) gemeinsam gehalten. Die Unterbringung der einzelnen Hamsterpaare war in einzelnen Käfigsystemen streng getrennt, um ein Übergreifen zwischen verschiedenen Paaren zu verhindern. In den folgenden sieben Tagen (Tag 2 bis Tag 8 nach der Infektion) und am Tag 12 nach der Infektion wurde die Virusausscheidung zusätzlich zu einer täglichen körperlichen Untersuchung und einem Körperwiegeprogramm überwacht.

Um die Virusausscheidung zu bewerten, wurden Nasenspülungen von jedem Hamster einzeln unter einer kurzzeitigen Isoflurananästhesie entnommen. Beginnend mit dem Kontakthamster jedes Paares wurde jedes Nasenloch mit 100 μl PBS (1,0 × phosphatgepufferte Kochsalzlösung) gespült und der Rückfluss wurde sofort gesammelt. Für jedes Nasenloch und jeden Hamster wurde eine neue Pipettenspitze verwendet, um eine indirekte Übertragung von einem Hamster auf einen anderen zu verhindern. Darüber hinaus wurde zwischen den jeweiligen Paaren für jedes Hamsterpaar ein neues Anästhesiesystem verwendet. Am 8. Tag nach der Infektion wurde ein Kontakthamster tot aufgefunden. Obwohl sie bis zu 20 % ihres Körpergewichts verloren, erholte sich jeder zweite Hamster von der Krankheit. Unter Euthanasie wurden von jedem Hamster Serumproben entnommen.

Für den Versuchsaufbau zur Einzelvirusinfektion wurden jeweils sieben Hamster über den intranasalen Weg mit 105,1 TCID50 pro Hamster an SARS-CoV-2D614 oder 104,5 TCID50 pro Hamster an SARS-CoV-2G614 infiziert (berechnet aus der Rücktitration des Originalmaterials). ). Von Tag 1 bis Tag 4 wurden von diesen Hamstern Nasenspülungen durchgeführt und Veränderungen des Körpergewichts aufgezeichnet. Eine Gewebeprobe aus Atmungsorganen – einschließlich Nasenmuscheln, Luftröhrengewebe, kranialen, medialen und kaudalen Teilen der rechten Lunge und dem Lungenlymphknoten – wurde nach der Euthanasie dieser Hamster entnommen.

Entsprechend der Hamsterstudie wurden zwölf Frettchen (Mustela putorius furo) aus eigener Zucht in sechs Gruppen zu je zwei Individuen aufgeteilt. Frettchenpaare waren gleich alt (zwischen 4 und 18 Monaten). Insgesamt waren vier Frettchen weiblich (zwei Paare) und acht Frettchen männlich oder kastriert (vier Paare). Die Unterbringung jedes Frettchenpaares war streng in einzelne Käfigsysteme unterteilt, um ein Übergreifen zwischen verschiedenen Paaren zu verhindern. Pro separatem Käfig wurde ein einzelnes Frettchen intranasal geimpft, indem 125 μl des oben genannten Inokulums (105,4 TCID50 pro Frettchen, berechnet aus der Rücktitration des gleichmäßig gemischten Originalmaterials) in jedes Nasenloch unter einer kurzzeitigen Inhalationsanästhesie auf Isofluranbasis eingeträufelt wurden. Zeitpunkte und Probenahmetechnik entsprachen den bei Hamstern verwendeten Methoden, obwohl die Nasenspülung bei Frettchen mit 2 × 700 μl PBS pro Frettchen durchgeführt wurde. Das Kontaktfrettchen war nicht geimpft.

Organproben wurden in einer 1-ml-Mischung gleicher Volumina homogenisiert, die aus ausgewogenen Salzen von Hank (MEM) und ausgewogenen Salzen von Earle (MEM) bestand und 2 mM l-Glutamin, 850 mg l-1 NaHCO3, 120 mg l-1 Natriumpyruvat, ergänzt mit 10 % fötalem Kalb, enthielt Serum und 1 % Penicillin-Streptomycin bei 300 Hz für 2 Minuten unter Verwendung eines Tissuelyser II (Qiagen) und zentrifugiert, um den Überstand zu klären. Nukleinsäure wurde nach einem kurzen Zentrifugationsschritt oder Organprobenüberstand mit dem NucleoMag Vet Kit (Macherey Nagel) aus 100 μl der Nasenspülungen extrahiert. Die Viruslast in diesen Proben wurde mithilfe der nCoV_IP4 RT-PCR27 einschließlich Standard-RNA bestimmt, die durch digitale Tröpfchen-PCR mit einer Empfindlichkeit von 10 Kopien pro Reaktion absolut quantifiziert wurde. Die extrahierte RNA wurde anschließend einer MinION-Sequenzierung und einer digitalen Droplet-PCR unterzogen. Für die MinION-Sequenzierung wurden Amplikons mit Primern (WU-21-F: AATCTATCAGGCCGGTAGCAC; WU-86-R: CAACAGCTATTCCAGTTAAAGCAC) unter Verwendung von SuperScript IV One-step RT-PCR (Thermo Fisher Scientific) hergestellt. Die Amplikons wurden auf einem MinION-System von Oxford Nanopore unter Verwendung von Native Barcoding 1–12 (EXP-NBD104) bzw. 13–24 (EXP-NBD114) mit dem Ligation Kit SQK-LSK109 (Oxford Nanopore) sequenziert. Bibliotheken wurden auf R9.4.1-Durchflusszellen (FLO-MIN106D) auf einem MinION geladen, das an ein MinIT gekoppelt war. Die MinION-Datenanalyse wurde wie unter „Sequenzierung und Computeranalyse“ beschrieben durchgeführt.

Für die Analyse seltener Mutationen und Sequenzen auf Basis der digitalen Tröpfchen-PCR wurde das QX200 Droplet Digital PCR System von Bio-Rad verwendet. Das One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes (Bio-Rad) wurde gemäß den Anweisungen des Lieferanten angewendet. Für die Amplifikation eines 86-bp-Fragments beider S-Varianten wird der Vorwärtsprimer SARS2-S-1804-F (5′-ACA AAT ACT TCT AAC CAG GTT GC-3′) und der Rückwärtsprimer SARS2-S-1889 verwendet -R (5′-GTA AGT TGA TCT GCA TGA ATA GC-3′) wurden verwendet. Für den Nachweis der D- und G-Varianten in einer Probe wurden zwei allelspezifische fixierte Nukleinsäuresonden verwendet: SARS2-S-v1D-1834FAM (5′-FAM-TaT cAG gat GTt AAC-BHQ1-3′) und SARS2 -S-v3G-1834HEX (5′-HEX-T cAG ggt GTt AAC-BHQ1-3′) (die gesperrten Nukleinsäurepositionen sind in Kleinbuchstaben angegeben). Die Konzentration der Primer und Sonden betrug 20 μM bzw. 5 μM. Zur Datenanalyse wurde die Software QuantaSoft Analysis Pro (v.1.0.596) verwendet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der Nature Research Reporting Summary, die mit diesem Artikel verlinkt ist.

Sequenzdaten sind im NCBI Sequence Read Archive (SRA) unter der BioProject-Zugangsnummer PRJNA669553 verfügbar. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Diese Arbeit wurde vom Schweizerischen Nationalfonds (SNF) (Stipendien 31CA30_196644, 31CA30_196062 und 310030_173085), der Europäischen Kommission (Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network „HONOURS“; Fördervereinbarung Nr. 721367) und dem Horizon 2020-Projekt „VEO“ unterstützt ' Fördervertrag Nr. 874735), des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (BMBF) (Förderung RAPID, Nr. 01KI1723A) und aus Kernmitteln der Universität Bern und des Bundesministeriums für Ernährung und Landwirtschaft. Die hACE2-Knock-in-Mäuse (B6) wurden mit Unterstützung von NIH/NIAID P01AI059576 (Teilprojekt 5) und teilweiser Unterstützung von NIH/NIAID U54-AI-057158 generiert. Teilweise Unterstützung wurde von der COVID-19 Task Force des US Centers for Disease Control and Prevention bereitgestellt. Diese Arbeit wurde durch COVID-19-Sondermittel des Schweizer Bundesamts für Gesundheit und des Schweizer Bundesamts für Lebensmittelsicherheit und Veterinärwesen unterstützt. Wir danken A. Summerfield für seine Hilfe bei der Beschaffung von Mitteln der Schweizer Regierung. Wir danken der NGS-Plattform der Universität Bern; M. Lange, C. Korthase, M. Currie, G. Larson und S. Renzullo für ihre hervorragende technische Unterstützung; und F. Klipp, D. Fiedler, H. Manthei, C. Lipinski, J. Tang und A. Gödel für ihre unschätzbare Unterstützung bei den Tierversuchen. Diese Aktivität wurde vom CDC überprüft und im Einklang mit den geltenden Bundesgesetzen und CDC-Richtlinien durchgeführt: 45 CFR Teil 46, 21 CFR Teil 56; 42 USC Sekte. 241(d); 5 USC Sekte. 552a; 44 USC Sekte. 3501 ff. Die Ergebnisse und Schlussfolgerungen in diesem Artikel stammen von den Autoren und geben nicht unbedingt die offizielle Position der US-amerikanischen Zentren für die Kontrolle und Prävention von Krankheiten wieder.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Bin Zhou, Tran Thi Nhu Thao, Donata Hoffmann, Adriano Taddeo

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Charaf Benarafa, David E. Wentworth, Volker Thiel, Martin Beer

CDC COVID-19 Response, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, USA

Bin Zhou, Xiaoyu Fan, Li Wang, Jaber Hossain, Malania M. Wilson, Matthew W. Keller, Thomas J. Stark, John R. Barnes und David E. Wentworth

Institut für Virologie und Immunologie (IVI), Mittelhäusern, Schweiz

Tran Thi Nhu Thao, Adriano Taddeo, Nadine Ebert, Silvio Steiner, Jenna N. Kelly, Jasmine Portmann, Lisa Thomann, Hanspeter Stalder, Ronald Dijkman, Charaf Benarafa & Volker Thiel

Abteilung für Infektionskrankheiten und Pathobiologie, Vetsuisse-Fakultät, Universität Bern, Bern, Schweiz

Tran Thi Nhu Thao, Adriano Taddeo, Nadine Ebert, Fabien Labroussaa, Silvio Steiner, Jenna N. Kelly, Jasmine Portmann, Bettina Salome Trüeb, Lisa Thomann, Hanspeter Stalder, Ronald Dijkman, Joerg Jores, Charaf Benarafa & Volker Thiel

Graduiertenschule für Biomedizinische Wissenschaft, Universität Bern, Bern, Schweiz

Tran Thi Nhu Thao & Silvio Steiner

Institut für Diagnostische Virologie, Friedrich-Loeffler-Institut, Greifswald-Insel Riems, Deutschland

Donata Hoffmann, Anne Pohlmann, Jacqueline King, Nico Joel Halwe, Lorenz Ulrich, Bernd Hoffmann & Martin Beer

Institut für Veterinärbakteriologie, Vetsuisse-Fakultät, Universität Bern, Bern, Schweiz

Fabien Labroussaa, Bettina Salome Trüeb & Jörg Jores

Battelle Memorial Institute, Atlanta, GA, USA

Xudong Lin & Dan Cui

Institut für Zellbiologie, Universität Bern, Bern, Schweiz

Berta Pozzi

COMPATH, Institut für Tierpathologie, Universität Bern, Bern, Schweiz

Simone de Brot

Oak Ridge Institut für Wissenschaft und Bildung, Oak Ridge, TN, USA

Nannan Jiang

Institut für Infektionskrankheiten, Universität Bern, Bern, Schweiz

Ronald Dijkman

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VT, DEW, MB und CB konzipierten die Studie. TTNT, BZ, DH und AT führten die meisten Experimente durch. NE, SS, FL, JNK, HS, JP, BST, JJ, RD, DH, NJH, LU, JK, BP, AP, BH, XF, XL, LW, NJ, DC, JH, MMW, MWK, TJS, JRB, SdB und CB führten experimentelle Arbeiten durch und/oder stellten wesentliche experimentelle Systeme, Datenanalysen und Reagenzien zur Verfügung. VT, DEW, MB, CB, TTNT, BZ, NE, SS, LT, DH, NJH und LU haben das Manuskript geschrieben und die Figuren erstellt. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Charaf Benarafa, David E. Wentworth, Volker Thiel oder Martin Beer.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Informationen zum Peer-Review Nature dankt Stanley Perlman und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a, Affinität zwischen S und hACE2, bestimmt durch Biolayer-Interferometrie. Fc-markiertes hACE2 wurde auf die Oberfläche von Anti-Human-Fc-Einfang-Biosensoren geladen und die Assoziation wurde unter Verwendung von S (S-614D) oder S(D614G) (S-614G) durchgeführt, gefolgt von einer Dissoziation. Die Daten stellen drei biologische Replikate dar, und alle Wiederholungen mit statistischer Analyse sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt. b, Bindung von Polyhistidin-markiertem oder Fc-markiertem S1 an BHK-hACE2-Zellen, bestimmt durch Durchflusszytometrie. Die mittlere Fluoreszenzintensität wird für die entsprechende S1-Proteinkonzentration angezeigt. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von drei biologischen Replikaten. c, Replikation der Isolate SARS-CoV-2/USA-WA1/2020 (Isolat 614D) und SARS-CoV-2/Massachusetts/VPT1/2020 (Isolat 614G) in menschlichen NBE-Zellen bei 33 °C (links), 37 °C (Mitte) und 39 °C (rechts). Menschliche NBE-Zellen wurden mit 200.000 TCID50 jedes Virus infiziert. Die Überstände wurden alle 24 Stunden gesammelt und mittels TCID50-Assay titriert. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von vier Replikaten. Die statistische Signifikanz wurde durch einen zweiseitigen, ungepaarten Student-T-Test ohne Anpassungen für mehrere Vergleiche bestimmt. P-Werte (von links nach rechts): links, NS (nicht signifikant), P = 0,8098; NS, P = 0,7874; *P = 0,0328; NS, P = 0,1887; und NS, P = 0,5296; Mitte, NS, P = 0,1689; NS, P = 0,1475; NS, P = 0,1415; **P = 0,0033; und NS, P = 0,3184; rechts, *P = 0,0197; NS, P = 0,6018; NS, P = 0,3903; NS, P = 0,0898; und *P = 0,0445. d, Konkurrenztest von rekombinantem SARS-CoV-2D614 (614D) und SARS-CoV-2G614 (614G) in menschlichen NBE-Zellen bei 33 °C, 37 °C und 39 °C. Das Inokulum wurde durch Mischen zweier Viren im Verhältnis 9:1 basierend auf PFU pro ml hergestellt. Menschliche NBE-Zellen wurden mit 100.000 PFU der 9:1-Virusmischung infiziert (n = 4). Virale RNA wurde aus dem täglichen Überstand extrahiert und mittels NGS sequenziert. Prozentsatz der Sequenzierungslesevorgänge mit der Kodierung S oder S(D614G). Jedes Quadrat repräsentiert einen einzelnen Datenpunkt im Wettbewerbsexperiment. Für jeden Zeitpunkt wurde ein lineares Regressionsmodell basierend auf den Sequenzlesezahlen für S und S(D614G) erstellt und P-Werte für den Gruppenkoeffizienten (Variantenkoeffizienten) berechnet. P-Werte (von links nach rechts): links, NS, P = 0,1796; NS, P = 0,087; NS, P = 0,1147; NS, P = 0,1244; und *P = 0,0401; Mitte, NS, P = 0,9114; NS, P = 0,0715; NS, P = 0,1696; NS, P = 0,1696; und NS, P = 0,1657; rechts, NS, P = 0,1041; *P = 0,013; NS, P = 0,0645; *P = 0,0102; und *P = 0,0308. e, Katzenaugendiagramm, das die relativen replikativen Fitnesswerte von SARS-CoV-2G614 gegenüber SARS-CoV-2D614 in menschlichen NBE-Zellen für die in d durchgeführten Konkurrenzexperimente veranschaulicht. Jeder Punkt stellt einen einzelnen Datenpunkt dar, die Mittellinie stellt den Mittelwert dar und der schattierte Bereich stellt die Standardabweichung dar

Quelldaten

a, b, Katzenaugendiagramme, die die relativen replikativen Fitnesswerte von SARS-CoV-2D614 gegenüber SARS-CoV-2G614 in menschlichen Nasenepithelzellen (a) und menschlichen NBE-Zellen (b) für die in Abb. 1e, f gezeigten Konkurrenzexperimente veranschaulichen . Jeder Punkt stellt einen einzelnen Datenpunkt dar, die Mittellinie stellt den Mittelwert dar und der schattierte Bereich stellt die Standardabweichung dar

Quelldaten

a, Design und Erzeugung von hACE2-Knock-in-Mäusen. Die menschliche ACE2-cDNA wurde im Leseraster mit dem endogenen Initiationscodon von Maus-Ace2 in Exon 2 eingefügt, das gelöscht wurde. Die menschliche ACE2-cDNA wurde 5′ von einer loxP-Stelle (schwarzes Dreieck) und 3′ von einer FRT-Neomycin-FR--loxP-Kassette flankiert. Das Targeting-Konstrukt enthielt eine negative Selektionskassette (PGK-DTA), um die Selektion von Klonen mit homologer Rekombination zu verbessern. Chimäre männliche Mäuse, die den Zielort übertragen, wurden mit weiblichen Flp-Deleter-Mäusen gekreuzt, um das floxierte menschliche ACE2-Knock-in-Allel zu erzeugen. Dieses Allel kann verwendet werden: (1) ohne weitere Cre-vermittelte Rekombination (wie hier gezeigt) zur Untersuchung von hACE2-Knock-in-Mäusen, in denen die menschliche ACE2-cDNA anstelle von Maus-Ace2 exprimiert wird; (2) nach der Kreuzung mit einer Cre-Deleter-Mauslinie zur Erzeugung konstitutiver Ace2-Knockout-Mäuse; und (3) nach Kreuzung mit einer gewebespezifischen Cre-Linie. Ubiquitäre und gewebespezifische Knockout-Mäuse können mit herkömmlichen hACE2-transgenen Mäusen gekreuzt werden, um das endogene Maus-ACE2 zu entfernen, was Pathogenesestudien verfälschen könnte (aufgrund der Heterodimerisierung von ACE2). b, Verlust des Körpergewichts zu den angegebenen Zeitpunkten nach der Infektion von hACE2-Knock-in-Mäusen (n = 8) und Wildtyp-Mäusen (n = 9) sowie für scheininfizierte Wildtyp-Mäuse, deren Proben identisch waren (n = 10) . c, d, RT-qPCR-Analyse (c) und Virustiter (d) von Gewebehomogenaten inokulierter hACE2-Knock-in- und Wildtyp-Mäuse zu angegebenen Zeitpunkten. Olf., olfaktorisch. e, Prozentsatz der Sequenzierungslesevorgänge mit der Kodierung S oder S(D614G). Jedes Quadrat stellt Daten für eine einzelne Maus in einem Wettbewerbsexperiment dar. Für jeden Zeitpunkt wurde ein lineares Regressionsmodell auf Basis der Sequenzlesezahlen für S und S(D614G) erstellt. Für den Gruppenkoeffizienten (Variantenkoeffizient) wurden P-Werte berechnet. P-Werte (von links nach rechts): ***P = 0,0009; **P = 0,0020; NS, P = 0,7875; und *P = 0,0180. f, Katzenaugendiagramm, das die relativen replikativen Fitnesswerte von SARS-CoV-2D614 gegenüber SARS-CoV-2G614 aus oropharyngealen Abstrichen von hACE2-Knock-in-Mäusen im in Abb. 2 gezeigten Konkurrenzexperiment veranschaulicht. Verhältnisse von SARS-CoV-2G614 zu SARS-CoV-2D614 wurde nach dem Wettkampf mit der MinION-Sequenzierungsplattform zum im Diagramm angegebenen Zeitpunkt gemessen. Jeder Punkt stellt eine infizierte hACE2-Knock-in-Maus dar, die Mittellinie stellt den Mittelwert dar und der schattierte Bereich stellt die SD dar

Quelldaten

a: Verlust des Körpergewichts zu den angegebenen Zeitpunkten nach der Infektion von syrischen Hamstern. Spenderhamster (n = 6) (schwarze Punkte) wurden intranasal mit SARS-CoV-2D614 und SARS-CoV-2G614 im gleichen Verhältnis geimpft (1 × 104,77 TCID50 pro Hamster, bestimmt durch Rücktitration des ursprünglichen Inokulums). Vierundzwanzig Stunden nach der Infektion wurden naive Hamster (n = 6) (orangefarbene Dreiecke) in einem Eins-zu-eins-Versuchsaufbau in direktem Kontakt gehalten. b, RT-qPCR-Analyse einzelner Nasenspülproben von Spender- und Kontakthamstern. c, Körpergewichtsverlust zu den angegebenen Zeitpunkten nach der Infektion der Hamster. Syrische Hamster wurden über den intranasalen Weg mit 105,1 TCID50 pro Hamster SARS-CoV-2D614 (n = 7) (blaue Punkte) oder 104,5 TCID50 pro Hamster SARS-CoV-2G614 (n = 7) (rote Dreiecke) geimpft. Die Titer wurden durch Rücktitration des ursprünglichen Impfmaterials bestimmt. d, Die Anzahl der viralen Genomkopien wird angezeigt, wie durch RT-qPCR aus einzelnen Nasenwaschproben der Hamster bestimmt, die mit einer einzelnen Virusvariante geimpft wurden. e, RT-qPCR-Analyse von Gewebehomogenaten inokulierter Hamster der SARS-CoV-2D614-Gruppe (n = 7) (blaue Punkte) im Vergleich zur SARS-CoV-2G614-Gruppe (n = 7) (rote Dreiecke). f, Prozentsatz der Sequenzierungslesevorgänge mit der Kodierung S oder S(D614G). Jedes Quadrat stellt Daten für einen einzelnen Hamster im Konkurrenzexperiment dar. Für jeden Zeitpunkt wurde ein lineares Regressionsmodell auf Basis der Sequenzierungslesezahlen für S und S(D614G) erstellt. Für den Gruppenkoeffizienten (Variantenkoeffizient) wurden P-Werte berechnet. ***P = 0,0007; ****P < 0,0001. g, Katzenaugendiagramm, das die relativen Replikationsfitnesswerte von SARS-CoV-2G614 gegenüber SARS-CoV-2D614 für infizierte Hamster aus dem in Abb. 3 gezeigten Konkurrenzexperiment zeigt. Die Verhältnisse von SARS-CoV-2G614 zu SARS-CoV-2D614 betrugen gemessen nach dem Wettkampf mit der MinION-Sequenzierungsplattform zu den im Diagramm angegebenen Zeitpunkten. Jeder Punkt stellt einen infizierten Hamster dar (n = 6), die Mittellinie stellt den Mittelwert dar und der schattierte Bereich stellt die Standardabweichung dar

Quelldaten

Spenderfrettchen (schwarze Punkte) (n = 6) wurden intranasal mit 105,4 TCID50 pro Frettchen geimpft, bestimmt durch Rücktitration eines Inokulums, das gleiche Verhältnisse von SARS-CoV-2D614 und SARS-CoV-2G614 enthielt. Vierundzwanzig Stunden nach der Inokulation wurde ein Kontaktfrettchen (orangefarbenes Dreieck) (n = 6) mit einem Spenderfrettchen vermischt, wodurch sechs Spender-Kontaktfrettchen-Paare entstanden. a: Das individuelle Körpergewicht der Frettchen an den angegebenen Tagen wird im Verhältnis zum Tag der Inokulation aufgetragen. b, Genomkopiezahlen für inokulierte Spender- und Kontaktfrettchen. Einzelne Nasenspülproben der angegebenen Tage wurden mittels RT-qPCR nCoV_IP4 analysiert und die absoluten Zahlen wurden unter Verwendung eines Satzes Standard-RNA berechnet. Alle Spenderfrettchen (schwarze Punkte) wurden ab Tag 2 nach der Inokulation positiv auf virale RNA getestet (n = 6). Vier von sechs Kontaktfrettchen (orangefarbene Dreiecke) wurden ab Tag 4 (entspricht Tag 3 nach dem Kontakt) positiv auf virale RNA getestet. Zwei der sechs Kontaktfrettchen wurden während der gesamten Studie nie positiv auf virale RNA getestet. c, Prozentsatz der Sequenzierungslesevorgänge mit der Kodierung S oder S(D614G). Jedes Quadrat stellt Daten für ein einzelnes Frettchen im Wettbewerbsexperiment dar. Für jeden Zeitpunkt wurde ein lineares Regressionsmodell auf Basis der Sequenzlesezahlen für S und S(D614G) erstellt. Für den Gruppenkoeffizienten (Variantenkoeffizient) wurden P-Werte berechnet. P-Werte (von links nach rechts): ***P = 0,0001; **P = 0,0090; **P = 0,0030; *P = 0,0352; *P = 0,0393; *P = 0,0411; und NS, P = 0,2883. d, Katzenaugendiagramm, das die relativen Replikationsfitnesswerte von SARS-CoV-2G614 gegenüber SARS-CoV-2D614 bei infizierten Frettchen aus dem in Abb. 4 gezeigten Konkurrenzexperiment veranschaulicht. Die Verhältnisse von SARS-CoV-2G614 zu SARS-CoV-2D614 betrugen gemessen nach dem Wettkampf mit der MinION-Sequenzierungsplattform zu den im Diagramm angegebenen Zeitpunkten. Jeder Punkt stellt ein infiziertes Frettchen dar (n = 6), die Mittellinie stellt den Mittelwert dar und der schattierte Bereich stellt die Standardabweichung dar

Quelldaten

Bindung von Fc-markiertem SARS-CoV-2 S1-614D an Wildtyp-BHK-Zellen und BHK-Zellen, die exogenes hACE2 exprimieren.

Gating-Strategie für Durchflusszytometriedaten.

Eine Liste der in dieser Studie verwendeten Primer.

Affinität zwischen S1 und hACE2 bestimmt durch Bioschicht-Interferometrie.

Pathologie von Mäusen.

Pathologie-Scores von Mäusen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Zhou, B., Thao, TTN, Hoffmann, D. et al. Die Veränderung des SARS-CoV-2-Spikes D614G verbessert die Replikation und Übertragung. Natur 592, 122–127 (2021). https://doi.org/10.1038/s41586-021-03361-1

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Eingegangen: 15. Oktober 2020

Angenommen: 16. Februar 2021

Veröffentlicht: 26. Februar 2021

Ausgabedatum: 01. April 2021

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-021-03361-1

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