Oxidativer Stress wirkt sich unterschiedlich auf die apikale und basolaterale Sekretion angiogener Faktoren aus menschlichen iPSC aus

Aug 23, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 12694 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine polarisierte Monoschicht, die Wachstumsfaktoren und Zytokine in Richtung der Netzhaut apikal und der Aderhaut basolateral absondert. Zahlreiche von RPE sezernierte Proteine ​​wurden mit der Pathogenese der altersbedingten Makuladegeneration (AMD) in Verbindung gebracht. Der Zweck dieser Studie bestand darin, das unterschiedliche apikale und basolaterale Sekretom von RPE-Zellen und die Auswirkungen von oxidativem Stress auf die gerichtete Sekretion von Proteinen zu bestimmen, die mit AMD und Angiogenese verbunden sind. Tandem-Massen-Tag-Spektrometrie wurde verwendet, um Proteine ​​in humanen iPSC-RPE-apikalen und basolateralen konditionierten Medien zu profilieren. Veränderungen der Sekretion nach oxidativem Stress, der durch H2O2 oder tert-Butylhydroperoxid (tBH) induziert wurde, wurden mittels ELISA und Western-Analyse untersucht. Von den 926 unterschiedlich sezernierten Proteinen waren 890 (96 %) eher apikal. Oxidativer Stress veränderte die Sekretion mehrerer Faktoren, die an AMD und Neovaskularisation beteiligt sind, und förderte eine proangiogene Mikroumgebung, indem er die Sekretion proangiogener Moleküle (VEGF, PTN und CRYAB) erhöhte und die Sekretion antiangiogener Moleküle (PEDF und CFH) verringerte ). Die apikale Sekretion war bei PEDF, CRYAB und CFH stärker beeinträchtigt als die basolaterale, während die basolaterale Sekretion bei VEGF stärker beeinträchtigt war, was Auswirkungen auf die choroidale Neovaskularisation haben könnte. Diese Studie legt den Grundstein für Untersuchungen der gestörten RPE-polarisierten Proteinsekretion bei AMD und anderen chorioretinalen degenerativen Erkrankungen.

Trotz Fortschritten in der Behandlung bleibt AMD in den Vereinigten Staaten die häufigste Ursache für Blindheit bei Erwachsenen über 651 Jahren. Obwohl die primären Pathomechanismen der AMD diskutiert werden, ist die Krankheit auf zellulärer Ebene durch RPE-Dysfunktion und metabolischen Stress gekennzeichnet Sub-RPE-Ablagerungen, darüber liegendes Absterben von Photorezeptoren und darunter liegendes Absterben von Aderhautendothelzellen und anschließende Ausdünnung der Aderhaut. Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist ein produktiver Sekretor von Wachstumsfaktoren und Zytokinen, der in Richtung der Photorezeptoren auf der apikalen Seite und des Aderhautgefäßsystems auf der basolateralen Seite polarisiert ist. Störungen der gerichteten RPE-Proteinsekretion wurden mit der chorioretinalen Degeneration, einschließlich AMD2, in Verbindung gebracht. Diese früheren Studien zeigen, dass RPE-Zellen den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), der die Angiogenese fördert, in Richtung der Aderhaut und den vom Pigmentepithel abgeleiteten Faktor (PEDF), der die Angiogenese hemmt, in Richtung der Photorezeptoren absondern3. Zusätzliche Proteine ​​mit AMD-Risiko-Allelen, wie Komplementfaktor H und Fibulin 5, werden ebenfalls gezielt von RPE-Zellen sezerniert2,4. Darüber hinaus zeigt das RPE eine gerichtete Sekretion von Proteinen, die von Genen der Mendelschen Krankheit kodiert werden, wie TIMP3 und EFEMP1, die die Makuladystrophie Sorsby bzw. die Makuladystrophie Doyne Honeycomb verursachen5,6.

Das polarisierte Sekretom von RPE-Zellen wurde nicht vollständig dokumentiert, und es bleibt unbekannt, welche zusätzlichen RPE-sekretierten Proteine ​​die Gesundheit von Netzhaut und Aderhaut beeinflussen könnten. In vielen früheren Studien zum RPE-Sekretom wurden herkömmliche Zellkulturen in Plastikvertiefungen verwendet und daher nur apikal konditionierte Medien untersucht und keine basolateral sezernierten Proteine ​​eingefangen, was sich sowohl auf die Neovaskularisation der Aderhaut als auch auf die Degeneration der Aderhaut bei geografischer Atrophie auswirken kann7,8,9. Neuere Studien haben sowohl die apikale als auch die basolaterale Proteinsekretion untersucht, da das Verständnis des differentiell polarisierten Sekretoms von RPE-Zellen die Grundlage für Untersuchungen der dysfunktionalen Proteinsekretion bei AMD und anderen chorioretinalen degenerativen Erkrankungen ist10,11. Der Zweck dieser Studie besteht darin, die gerichtete Sekretion von RPE-Proteinen weiter zu untersuchen und zu untersuchen, wie sich oxidativer Stress auf die polarisierte Sekretion von Proteinen auswirken kann, die bei AMD wichtig sind. Eine von menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) abgeleitete RPE-Linie wurde auf durchlässigen Trägern gezüchtet, was die Beurteilung sowohl des apikalen als auch des basolateralen Profils sekretierter Proteine ​​ermöglichte, wobei der Schwerpunkt speziell auf den Proteinen lag, von denen bekannt ist, dass sie extrazellulär funktionieren und daher möglicherweise die angrenzenden Photorezeptoren und die Aderhaut beeinflussen Gefäßsystem. Mithilfe von H2O2- und Tert-Butylhydroperoxid (tBH)-Modellen für oxidativen Stress zeigen wir Veränderungen in der Richtungssekretion von RPE-Proteinen, die zur Neovaskularisierung beitragen könnten.

Von iPSC abgeleitete RPE-Zellen (iPSC-RPE) wurden auf durchlässigen Trägern gehalten und zwischen 2 und 6 Monaten nach der Passage verwendet. iPSC-RPE hatte eine angemessene Melaninpigmentierung und Kopfsteinmorphologie und einen Anstieg des TEER ab 2 Wochen nach der Passage, mit einem Plateau bei durchschnittlich 312 Ω cm2 nach 8 Wochen (Abb. 1A, B). Die Zellen zeigten eine Expression von RPE-Markern und eine entsprechende Lokalisierung von Membranproteinen (Abb. 1C, D). iPSC-RPE-Zellen wurden in serumfreiem Medium gehalten, das B27-Ergänzung mit Albumin enthielt. Um das Sekretom mittels Massenspektrometrie zu analysieren, ohne dass große Mengen Albumin die Ergebnisse verfälschen, wurde ein B18-Ergänzungsmittel ähnlich wie B27 ohne Albumin formuliert. iPSC-RPE in B18-ergänzten Medien hielt über Nacht einen TEER aufrecht, der dem von Standard-B27-ergänzten Medien ähnelte (ergänzende Abbildung 1).

Humanes iPSC-RPE zeigt eine angemessene Polarität und Differenzierung (A) mit Melaninpigmentierung und Kopfsteinpflastermorphologie (B) und einen Anstieg des TEER nach Durchgang durch Transwell-Filter. N = 6–65 biologische Replikate je nach Zeitpunkt, keine technischen Replikate. Datenpunkte zeigen Mittelwert ± SD. (C) RT-PCR von RPE-Markern in iPSC-RPE 11 Wochen nach der Passage im Vergleich zu primären adulten menschlichen RPE- und ARPE19-Zellen 4 Wochen und 8 Monate nach der Passage (nicht zugeschnittene Bilder sind in der ergänzenden Abbildung 3 dargestellt). (D) ICC von iPSC-RPE für ZO-1 an Tight Junctions und CD147, Ezrin und Kir7.1 in der apikalen Membran. Phalloidin ist rot und DAPI ist blau. Die Färbung wird sowohl vor (Kontrolle) als auch nach (Post-H2O2) Exposition gegenüber 800 µM H2O2 für 24 Stunden gezeigt.

Konditionierte B18-Medien wurden nach 16 Stunden in apikalen und basolateralen Kammern von dreifachen Sätzen von Vertiefungen gesammelt und konzentriert, und es wurde eine Tandem-Massen-Tag-Spektrometrie durchgeführt. Der Versuchsaufbau ist in der ergänzenden Abbildung 2 dargestellt. Um den Volumenunterschied zwischen apikalen und basolateralen Kammern zu berücksichtigen, wurden die Rohzahlen aus der Massenspektrometrie entsprechend dem Konzentrationsfaktor angepasst, um die Gesamtmenge jedes apikal abgesonderten Proteins mit der Gesamtmenge jedes apikal abgesonderten Proteins zu vergleichen basolateral. Insgesamt wurden 1421 sekretierte Proteine ​​identifiziert. Unter Verwendung der Kriterien einer mindestens zweifachen Differenz und eines p-Werts < 0,05 (bereinigt um die Rate falscher Entdeckungen) wiesen 926 Proteine ​​eine unterschiedliche Sekretion zwischen dem apikalen und dem basolateralen Kompartiment auf. Aus Gründen der Reproduzierbarkeit wurde ein zweiter Datensatz unter Verwendung von 4 Replikatsätzen von Vertiefungen erhalten, wobei gleiche Medienvolumina (800 ml) sowohl in der apikalen als auch in der basolateralen Kammer verwendet wurden. Der zweite Datensatz zeigte insgesamt Übereinstimmung mit dem ersten. Insgesamt wurden 1320 sekretierte Proteine ​​identifiziert (im Vergleich zu 1421), und 732 Proteine ​​zeigten eine unterschiedlich gerichtete Sekretion (im Vergleich zu 926). Die geringere Proteinzahl ist auf fehlende Werte zurückzuführen, was mit zunehmender Probenzahl wahrscheinlicher ist. Insgesamt wurden 87 % (637/732) der unterschiedlich sezernierten Proteine ​​in Datensatz 2 eher apikal sezerniert (Abb. 2A). Die durchschnittliche Anzahl einzigartiger Peptide pro Protein betrug 4,2 in Datensatz 1 gegenüber 4,8 in Datensatz 2 (p < 0,01). Angesichts der höheren Anzahl an Replikaten und der höheren Anzahl eindeutiger Peptide, die pro Protein nachgewiesen wurden, wurde Datensatz 2 für die Tabellen 1, 2, 3 verwendet. Die Pathway-Analyse mit Advaita iPathwayGuide zeigte, dass molekulare Funktionen, die die Bindung von Nukleinsäure und Nukleinsäuresubstrat umfassen, sowie Die GTPase-Aktivität war in den unterschiedlich sezernierten Proteinen deutlich angereichert (Abb. 2B)12,13. G-Proteine ​​und GTPase-Aktivität sind in zahlreichen Zellprozessen wichtig, einschließlich des Sehzyklus und des Membrantransports, und Nukleinsäure-Sensorproteine ​​in RPE-Zellen können bei Entzündungen und altersbedingter Makuladegeneration wichtig sein14.

Das polarisierte iPSC-RPE-Sekretom des Menschen ist eher apikal als basolateral. (A) Vulkandiagramm aus Datensatz 2, das Proteine ​​mit mindestens zweifacher Veränderung und p < 0,05 zeigt, in blau (basolateraler) oder rot (apikaler). N = 4 biologische Replikate. Die drei am unterschiedlichsten sezernierten Proteine ​​sowohl im apikalen als auch im basolateralen Kompartiment sowie die im Abschnitt „Ergebnisse“ beschriebenen Proteine ​​von Interesse sind in der Grafik mit der Nummer gekennzeichnet: 1. RNF7, 2. TIMP3, 3. UBR, 4. PTPN22 , 5. CFI, 6. VEGF, 7. C1QTNF5, 8. PTN, 9. HTRA1, 10. CFH, 11. PEDF, 12. RPL12, 13. HMGN2, 14. CRYAB, 15. PSMA1. (B) Dendrogramm aus Datensatz 2, das molekulare Funktionen zeigt, die in apikalen und basolateralen Proben unterschiedlich dargestellt wurden (p < 0,05, angepasst an die Rate falscher Entdeckungen). Die Analyse wurde mit Advaita Bio ipathwayguide12,13 durchgeführt.

Um die potenziellen Auswirkungen von RPE-sekretierten Proteinen auf die angrenzenden Gewebe (die neurosensorische Netzhaut und das Aderhautgefäßsystem) zu untersuchen, konzentrierte man sich auf „Effektorproteine“, also Proteine, von denen bekannt ist, dass sie extrazellulär und nichtautonom funktionieren, wodurch primär intrazelluläre Proteine ​​ausgeschlossen wurden werden als zellulärer Abfall oder Überschuss ausgeschieden. Wir haben die Kategorien Wachstumsfaktoren und Zytokine, Proteasen, Proteaseinhibitoren, extrazelluläre Matrixkomponenten, Komplementkaskadenproteine ​​und Lipidhomöostaseproteine ​​einbezogen. Annotationen in Advaita wurden verwendet, um Proteine ​​in jeder Kategorie zu identifizieren, und wurden mit UniProt abgeglichen, um extrazelluläre Proteine ​​zu identifizieren (Tabelle 1)12,15. Die größte Proteinkategorie waren Proteasen. Ähnlich dem Gesamttrend des polarisierten Sekretoms, der in Abb. 2A zu sehen ist, wurde die überwiegende Mehrheit dieser Proteine ​​mehr apikal als basolateral sezerniert.

Mehrere bekannte Krankheitsgene wurden von RPE-Zellen sezerniert (siehe Tabelle 2). Mendelsche Krankheitsgene, die unterschiedlich sezerniert wurden, wurden durch Annotation in Advaita identifiziert, und zusätzliche AMD-Risiko-Loci sind ebenfalls in Tabelle 2 enthalten. Ein wichtiger Proteaseinhibitor, TIMP3, wurde zehnmal häufiger in die basolaterale Kammer sezerniert (p < 0,01). Mutationen in TIMP3 verursachen Sorsby-Makuladystrophie, eine autosomal-dominant vererbte Makuladystrophie mit früh einsetzender Makulaatrophie und schwerer aggressiver choroidaler Neovaskularisation. Risikoallele für AMD wurden auch in TIMP316 identifiziert. Die spät einsetzende Netzhautdegeneration (LORD), eine Erkrankung mit chorioretinaler Degeneration des hinteren Pols im späten Erwachsenenalter, wird durch Mutationen in C1QTNF5 verursacht, das für ein Protein unbekannter Funktion kodiert. Das C1QTNF5-Protein wurde von RPE-Zellen gleichermaßen in apikaler und basolateraler Richtung sezerniert. CFH und HTRA1/ARMS2 sind die am besten etablierten Risikoorte für AMD17,18,19. CFH- und HTRA1-Proteine ​​wurden beide aus RPE sezerniert, und zwar gleichermaßen in apikaler und basolateraler Richtung. CFI, das auch AMD-Risikoallele aufweist, wurde eher basolateral als apikal sezerniert (p < 0,01)18. Es wurde gezeigt, dass CFH die Neovaskularisation hemmt, und ein Funktionsverlust von CFH ist mit einer erhöhten Komplementaktivierung, Entzündung und einem erhöhten AMD-Risiko verbunden18,19,20. HTRA1 ist eine Serinprotease und ist dafür bekannt, EFEMP1 und THBS1 abzubauen, die beide von RPE-Zellen sezerniert werden21.

Andere Proteine, die für die Regulierung der Angiogenese wichtig sind, wurden ebenfalls gezielt sezerniert (Tabelle 3). VEGF zeigte einen nicht signifikanten Trend zur gerichteten basolateralen Sekretion. PEDF, das die Angiogenese hemmt und die Apoptose von Endothelzellen induziert, wurde 2,9-fach häufiger apikal als basolateral ausgeschieden (p < 0,01). CRYAB, das Caspase 3 hemmt, eine neuroprotektive Wirkung auf Photorezeptoren hat und auch die VEGF-Signalisierung und Angiogenese fördert, wurde durch RPE 10,2-fach stärker apikal als basolateral sezerniert (p < 0,0001)2. PTN, das eine komplexe Rolle bei der Angiogenese bei zahlreichen Krankheiten, einschließlich Krebs, spielt, spielt wahrscheinlich eine proangiogene Rolle bei der diabetischen Retinopathie22,23. PTN wurde gleichermaßen in apikaler und basolateraler Richtung abgesondert.

Um die Auswirkungen von oxidativem Stress auf die gerichtete Proteinsekretion zu untersuchen, wurden Zellen H2O2 oder tBH ausgesetzt. H2O2 wurde ausgiebig zur Modellierung von oxidativem Stress bei AMD verwendet und es wurde zuvor gezeigt, dass es die RPE-Sekretion von VEGF erhöht24,25. tBH wurde als zweites Oxidationsmittel verwendet, basierend auf früheren Berichten über eine überlegene Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in ARPE19-Zellen mit tBH im Vergleich zu H2O226. iPSC-RPE-Zellen wurden 24 Stunden lang mit 800 µM H2O2 oder 6 Stunden lang mit 1 mM tBH behandelt, mit oder ohne Vorbehandlung mit Quercetin, einem ROS-Fänger, der zuvor zum Schutz von RPE-Zellen vor oxidativem Stress eingesetzt wurde27. Die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) wurde mit Carboxy-H2DCFDA gemessen, einem zelldurchlässigen Reagenz, das nach Reaktion mit intrazellulären ROS fluoresziert (Abb. 3). iPSC-RPE ROS stieg nach der Exposition gegenüber H2O2 oder tBH signifikant an, und der Effekt wurde in jedem Fall durch die ROS-Fängung durch Quercetin behoben. Für H2O2 wurde die längere Inkubation von 24 Stunden gewählt, da nach einer Inkubationszeit von 6 Stunden keine ROS mehr nachgewiesen wurden (Daten nicht gezeigt). Der TEER von iPSC-RPE erholte sich innerhalb von 48 Stunden nach jeder Behandlung auf den Ausgangswert, was auf die allgemeine Gesundheit und Lebensfähigkeit der Zellen hinweist.

Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) nach oxidativem Stress in iPSC-RPE. Die Grafik zeigt die relative Fluoreszenzdetektion, nachdem iPSC-RPE entweder 800 µM H2O2 oder 1 mM tBH ausgesetzt wurde, mit oder ohne Vorbehandlung mit 400 µM Quercetin, wobei Carboxy-H2DCFDA als fluoreszierender zellpermeabler Indikator für ROS verwendet wurde. Für die H2O2-Experimente ist n = 12 für die H2O2-Gruppe und n = 6 für die Kontrollgruppe und die H2O2 + Quercetin-Gruppe. Für die tBH-Experimente ist n = 5 für alle Gruppen. Alle Replikate waren biologisch; es gab keine technischen Nachbildungen. Die Ergebnisse wurden für die H2O2-Experimente aufgrund der ungleichen Probengröße mit Kruskal-Wallis und für die tBH-Experimente mit einer einfachen ANOVA analysiert. *p < 0,05, ****p < 0,0001, ns = nicht signifikant.

iPSC-RPE-Zellen in 9 Replikatvertiefungen wurden mit H2O2 oder tBH behandelt und konditioniertes Medium wurde 48 Stunden später gesammelt und mittels ELISA auf VEGF, PEDF, CFH und PTN analysiert (Abb. 4). Der Vergleich der Konzentrationen an apikalem und basolateralem Protein vor der Behandlung bestätigt die Ergebnisse der Massenspektrometrie. Die in der Massenspektrometrie beobachteten nicht signifikanten Trends einer stärkeren basolateralen Sekretion von VEGF und einer stärkeren apikalen Sekretion von CFH und PTN wurden bestätigt und waren unter Verwendung von 9 Replikatvertiefungen im ELISA signifikant (p < 0,0001 für VEGF und CFH und p < 0,01 für PTN). . PEDF wurde deutlich stärker apikal abgesondert, ähnlich den Ergebnissen der Massenspektrometrie (p < 0,0001).

H2O2-induzierter oxidativer Stress verändert die RPE-polarisierte Sekretion angiogener regulatorischer Faktoren. Balkendiagramme zeigen Unterschiede in der apikalen und basolateralen Sekretion von VEGF, PEDF, CFH und PTN vor (Vorbehandlung, schwarz) und nach Inkubation mit (A) 800 µM H2O2 für 24 Stunden (Post-H2O2, hellgrau) oder ( B) 1 mM tBH für 6 Stunden (Post-tBH, hellgrau). Dunkelgraue Balken zeigen die schützende Wirkung einer Quercetin-Vorbehandlung vor oxidativem Stress mit H2O2 oder tBH. N = 9. Die Ergebnisse wurden mittels gepaarter 2-Wege-ANOVA analysiert. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, ns = nicht signifikant. Es gab keine signifikante Wechselwirkung zwischen Polarität und Behandlungseffekten für PTN, es werden jedoch weiterhin p-Werte für Post-hoc-Vergleiche angezeigt.

Die Behandlung mit H2O2 und tBH veränderte die Sekretion aller vier Proteine ​​deutlich, und in allen Fällen konnte die veränderte Sekretion zumindest teilweise durch eine Vorbehandlung mit Quercetin wiederhergestellt werden (Abb. 4). Bei allen 4 Proteinen waren die Effekte mit tBH größer als mit H2O2. Die jeweiligen Auswirkungen sind in Abb. 4 zu sehen, wobei die Auswirkungen von tBH hier beschrieben werden. Die Behandlung mit tBH erhöhte die RPE-Sekretion von VEGF sowohl in apikaler als auch in basolateraler Richtung (2,4-fach bzw. 3,4-fach). Eine Vorbehandlung mit Quercetin rettete diesen Effekt und reduzierte die VEGF-Sekretion unter den Ausgangswert. Die zweistufige ANOVA mit gepaartem Design zeigte signifikante Haupteffekte sowohl der Polarität (F(1,8) = 3409, p < 0,0001) als auch der Behandlung (F(2,16) = 19.908, p < 0,0001) sowie einen signifikanten Wechselwirkung, was darauf hindeutet, dass oxidativer Stress die basolaterale Sekretion stärker beeinflusst als die apikale Sekretion (F(2,16) = 5934, p < 0,0001). Im Gegensatz dazu verringerte die tBH-Behandlung die RPE-Sekretion von PEDF sowohl in apikaler als auch in basolateraler Richtung dramatisch (24,0-fach bzw. 6,9-fach). Eine Vorbehandlung mit Quercetin konnte diesen Rückgang teilweise beheben. Die zweistufige ANOVA zeigte erneut signifikante Haupteffekte sowohl der Polarität (F(1,8) = 411, p < 0,0001) als auch der Behandlung (F(2,16) = 435, p < 0,0001) sowie eine signifikante Wechselwirkung ( F(2,16) = 243, p < 0,0001), was zeigt, dass oxidativer Stress die apikale Sekretion von PEDF stärker beeinflusst als die basolaterale.

Oxidativer Stress mit tBH verringerte auch die CFH-Sekretion sowohl apikal als auch basolateral (23,4-fach bzw. 22,4-fach). Während Quercetin diesen Effekt deutlich rettete, war die Rettung bei CFH geringer als bei den anderen getesteten Proteinen. Es gab einen signifikanten Effekt der Polarität (F(1,8) = 135, p < 0,0001) und der Behandlung (F(2,16) = 1820, p < 0,0001) sowie eine signifikante Wechselwirkung (F(2,16). ) = 95, p < 0,0001). Die Auswirkungen von tBH auf die Sekretion von PTN waren geringer, aber tBH steigerte sowohl die apikale als auch die basolaterale Sekretion signifikant (1,5-fach bzw. 1,6-fach), was durch Quercetin aufgehoben wurde. Obwohl es einen signifikanten Haupteffekt der Polarität (F(1,8) = 8, p < 0,05) und der Behandlung (F(2,16) = 210, p < 0,0001) gab, gab es keine signifikante Wechselwirkung zwischen Polarität und Behandlung. Dies legt nahe, dass oxidativer Stress die apikale und basolaterale Sekretion von PTN gleichermaßen beeinflusst. CRYAB war bei der Western-Blot-Analyse zu Studienbeginn nicht nachweisbar und zeigte nach oxidativem Stress mit H2O2 eine erhöhte apikale, aber nicht basolaterale Sekretion (Abb. 5). Im Gegensatz dazu erhöhte tBH sowohl die apikale als auch die basolaterale Sekretion von CRYAB. In allen Fällen verhinderte das Abfangen von ROS mit Quercetin eine erhöhte CRYAB-Sekretion.

Durch H2O2 und tBH induzierter oxidativer Stress erhöht die RPE-polarisierte CRYAB-Sekretion. Der Western Blot zeigt CRYAB in apikalen und basolateralen konditionierten Medien vor (PRE) und nach (POST) Inkubation mit (A) 800 µM H2O2 für 24 Stunden oder (B) 1 mM tBH für 6 Stunden, mit oder ohne Vorbehandlung mit Quercetin . Da es kein endogenes Protein gibt, das für die Normalisierung zwischen apikalen und basolateralen Proben geeignet ist, wurden den Proben gleiche Mengen Recoverin (RCVRN) zugesetzt und als Kontrollen verwendet. N = 3. Zugeschnittene Blots werden angezeigt. Unbeschnittene Bilder finden Sie in der ergänzenden Abbildung 4.

In dieser Studie wurden menschliche iPSC-RPE-Zellen verwendet, um die gerichtete Sekretion zahlreicher Effektorproteine ​​mit nachgewiesener Rolle bei Netzhauterkrankungen zu demonstrieren. Ein Modell für oxidativen Stress bei AMD veränderte die gerichtete Sekretion von Proteinen, die mit AMD und Angiogenese in Zusammenhang stehen, signifikant zugunsten einer proangiogenetischen Mikroumgebung. Für VEGF, PEDF und CFH zeigten 2-Wege-ANOVA-Tests eine signifikante Wechselwirkung zwischen Polarität und H2O2, was darauf hindeutet, dass oxidativer Stress die apikale und basolaterale Sekretion unterschiedlich beeinflusst. Für CRYAB war eine Quantifizierung vor der Behandlung mittels ELISA nicht möglich, da das Protein nicht nachweisbar war. Der Western Blot zeigte jedoch, dass oxidativer Stress die apikale Sekretion und nicht die basolaterale Sekretion bei Verwendung von H2O2 sowie sowohl die apikale als auch die basolaterale Sekretion bei Verwendung von tBH stark erhöhte. Dies ist wahrscheinlich auf die erhöhte Wirksamkeit der ROS-Produktion unter Verwendung von tBH zurückzuführen, wie in Abb. 3 dargestellt. Die veränderte Sekretion von Proteinen wurde zumindest teilweise durch das Auffangen von ROS unter Verwendung von Quercetin wiederhergestellt. Eine veränderte gerichtete Proteinsekretion von RPE-Zellen könnte eine wichtige Rolle in der AMD-Pathophysiologie spielen.

Humanes iPSC-RPE wurde ausgewählt, um menschliche Krankheiten genauer zu modellieren und die Mängel der häufig verwendeten ARPE19-Zelllinie zu vermeiden, einschließlich Anomalien in der Polarität und der polarisierten Sekretion28,29. Das wachsende Feld der Modellierung von RPE-Erkrankungen nutzt zunehmend iPSC-RPE-Zellen, die leicht im Labor erzeugt werden können, terminal differenziert und nicht immortalisiert sind und keine wiederkehrenden Gewebespenden für die Primärkultur erfordern. Die in dieser Studie verwendete iPSC-RPE-Linie zeigte Merkmale von echtem RPE, einschließlich korrekter Pigmentierung, Morphologie, Barriereeigenschaften und RPE-Marker-Expression. Eine weitere Stärke unserer Studie war die Verwendung durchlässiger Träger zur getrennten Analyse der apikalen und basolateralen Sekretion. Frühere Studien mit auf Kunststoff gezüchteten RPE-Zellen haben nur die apikale Oberfläche dem Medium ausgesetzt und konnten daher Änderungen in der basolateralen Proteinsekretion nicht erfassen. Mehrere Wachstumsfaktoren und Zytokine wurden in unserer Studie hauptsächlich basolateral abgesondert, ein Befund, der ohne die Verwendung durchlässiger Träger übersehen würde. Aderhautneovaskularisation sowie Aderhautatrophie spielen in der AMD-Pathologie eine herausragende Rolle. Daher können Veränderungen des basolateralen Wachstumsfaktors und der Zytokinsekretion von entscheidender Bedeutung für die Pathogenese sein. Unsere Studie beschränkt sich auf die Verwendung von oxidativem Stress, der nur ein vorgeschlagenes AMD-Modell unter vielen ist. Oxidativer RPE-Stress ist ein bekannter Bestandteil von AMD, es gibt jedoch noch viele andere Faktoren, die dazu beitragen.

In unserem Modell erhöhte oxidativer Stress die Sekretion proangiogener Faktoren (VEGF, PTN und CRYAB) und verringerte die Sekretion antiangiogener Faktoren (PEDF, CFH), was insgesamt zu einem angiogeneren Umfeld beitrug. CFH spielt auch eine etablierte Rolle bei der negativen Regulierung der Komplementaktivierung und Entzündung, mit Bedeutung sowohl für exsudative als auch nicht-exsudative AMD18,19,20. Bei VEGF war der erhöhte Sekretionseffekt eher basolateral als apikal, was insbesondere für die choroidale Neovaskularisation relevant sein könnte. Unsere Daten stimmen mit früheren Studien überein, die einen erhöhten VEGF als Reaktion auf oxidativen Stress zeigten30,31. Es wurde zuvor gezeigt, dass die H2O2-Behandlung von ARPE-19-Zellen die CFH-Expression reduziert, obwohl die Proteinsekretion nicht untersucht wurde20. Frühere Studien mit CRYAB haben eine neuroprotektive Wirkung sowie eine erhöhte RNA-Expression als Reaktion auf oxidativen Stress gezeigt32. Die dramatisch erhöhte apikale Sekretion von CRYAB nach oxidativem Stress in unseren RPE-Zellen könnte ein Kompensationsmechanismus zum Schutz der neurosensorischen Netzhaut sein. Es wurde jedoch auch gezeigt, dass CRYAB eine wichtige Rolle bei der Neovaskularisation spielt, da Alpha-Kristallin-b-Knockout-Mäuse in ischämischen und laserinduzierten Modellen resistent gegen retinale Neovaskularisation sind33. Eine erhöhte CRYAB-Sekretion kann daher zur exsudativen AMD beitragen, insbesondere nach einer RPE-Schädigung und einem Zusammenbruch der RPE-Barriere.

Andere Studien haben verschiedene Aspekte des RPE-polarisierten Sekretoms untersucht. Einige Studien verwendeten Massenspektrometrie, um nur das apikale Sekretom von RPE-Kulturen in traditionellen Kulturplatten zu charakterisieren, und fanden signifikante Veränderungen in sekretierten Proteinen, die an der Angiogenese und Komplementregulierung als Reaktion auf oxidativen Stress beteiligt sind7,9. Eine andere Studie untersuchte eine Teilmenge des RPE-polarisierten Sekretoms und untersuchte dabei insbesondere Proteine, die in Exosomen von Schweine-RPE34 enthalten sind. Exosomen sind Vesikel mit einer Größe von 30–150 nm, die verschiedene Ladungen enthalten, darunter Proteine, Lipide, RNA, DNA und Metaboliten. Es wurde auch berichtet, dass vier der in unserer Studie gefundenen unterschiedlich sezernierten RPE-Effektorproteine ​​(Alpha-Kristallin-b-Kette (CRYAB), Annexin A1 (ANXA1), Annexin A2 (ANXA2) und CD81) in apikalen Exosomen angereichert sind Die Ergebnisse unserer Studie zeigen eine gerichtete apikale Sekretion dieser Proteine. Andere Studien haben die Auswirkungen verschiedener Eingriffe, wie z. B. eine Zinkergänzung oder die Inaktivierung der Protease HtrA1, auf das apikale und basolaterale RPE-Sekretom untersucht10,11. Diese früheren Studien fanden ähnlich wie in unserer Studie mehr Proteine, die apikal als basolateral sezerniert wurden, obwohl sie für kein einzelnes Protein speziell die apikale mit der basolateralen Sekretion verglichen11,34. Ähnlich wie in unserer Studie wurden auch in diesen früheren Studien durchlässige Stützen verwendet, um die apikale und basolaterale Kammer zu trennen. Wir verwendeten Transwell-Polyestermembranen (PET), die 10 µM dick sind und 0,4 µM Poren bei einer Dichte von 4 × 106 Poren/cm2 aufweisen. Wir schätzen, dass es etwa 3–7 Poren pro RPE-Zelle geben würde. In vivo werden RPE-Zellen vom Aderhautgefäßsystem durch die Bruch-Membran getrennt, die je nach Alter 2–5 Mikrometer dick ist35. Wir können die Möglichkeit nicht ausschließen, dass der durchlässige Träger die Sekretion von Proteinen in die basolateralen Medien behindert und das Protein in basolateralen konditionierten Medien künstlich reduziert und daher die basolaterale Sekretion in die Aderhaut in vivo möglicherweise nicht vollständig modelliert.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass RPE-Zellen stark polarisiert sind und die gerichtete Sekretion von Effektorproteinen für die Homöostase der angrenzenden neurosensorischen Netzhaut und Aderhaut wichtig ist. Oxidativer Stress verschob das Gleichgewicht der RPE-sekretierten Faktoren zugunsten einer erhöhten Angiogenese und einer erhöhten Komplementaktivierung und wirkte sich unterschiedlich auf die apikale und basolaterale Sekretion aus, was wichtige Auswirkungen auf die choroidale Neovaskularisation haben könnte. Diese Ergebnisse unterstützen zukünftige Studien, die die Rolle unterschiedlich sezernierter RPE-Effektorproteine ​​für die Gesundheit von Photorezeptoren und Aderhaut untersuchen, um therapeutische Ziele bei AMD und anderen degenerativen Netzhauterkrankungen zu identifizieren.

Von gesunden Spenderhautfibroblasten abgeleitete iPSCs wurden von LAgen Labs (Linie 006-BIOTR-0001 Klon 1) erhalten. Diese Zelllinie wurde zuvor für die iPSC-RPE-Differenzierung verwendet und am Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine Biotrust durch Expression von Stammzellmarkern, normalen Karyotyp und Differenzierung in alle drei Keimschichten validiert36. Unsere Studie wurde vom HPSCRO-Ausschuss (Human Pluripotent Stem Cell Research Oversight) der University of Michigan genehmigt und die Experimente wurden gemäß deren Richtlinien durchgeführt. Die Qualitätskontrolle bei LAgen Labs umfasste iPSCs, die positiv auf die Pluripotenzmarker Oct4, SSEA, Nanog und TRA-1-60 gefärbt waren und eine normale Karyotypisierung aufwiesen. iPSCs wurden auf 6-Well-Platten in mTESR1-Medium kultiviert und bei Erreichen einer Konfluenz von 50–75 % passagiert. iPSCs wurden wie zuvor beschrieben in RPE differenziert37. Zwischen Tag 50 und Tag 90 wurden RPE-Kolonien, erkennbar an Pigmentierung und Kopfsteinpflaster-Morphologie, mit einer 21-Gauge-Nadel von den umgebenden Zellen seziert und auf eine mit Laminin beschichtete Platte mit 24 Vertiefungen in einer Dichte von 50.000 Zellen/Vertiefung übertragen. Nachdem iPSC-RPE konfluent geworden war und die entsprechende Pigmentierung und Morphologie wiedererlangt hatte, wurden die Zellen auf mit Laminin beschichtete Transwells geleitet. Die Zellen wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und mit Trypsin in einzelne Zellen dissoziiert und mit einer Dichte von 335.000 Zellen pro cm2 ausplattiert. Fötales Rinderserum (FBS) wurde den Medien eine Woche lang mit 10 %, eine Woche lang mit 3 % und eine Woche lang mit 2 % zugesetzt. Der TEER wurde einmal wöchentlich beginnend 4 Wochen nach der Passage mit einem EVOM-Gerät mit einer STX2-Elektrode (World Precision Instruments) gemessen. Für Experimente zu oxidativem Stress wurden iPSC-RPE-Zellen 24 Stunden lang mit 800 µm H2O2 oder 6 Stunden lang mit 1 mM tert-Butylhydroperoxid (tBH) inkubiert, dann auf Erhaltungsmedium umgestellt und konditioniertes Medium 48 Stunden später gesammelt.

Von iPSC abgeleitete RPE-Zellen wurden in 96-Well-Platten mit 120.000/cm2 ausgesät und vor dem Test 4–5 Wochen lang aufbewahrt. Für Versuchsgruppen mit Quercetin-Behandlung wurden die Zellen mit 400 µM Quercetin (#10005169 Cayman), verdünnt in RDM-Medium bei 37 °C, 2 Stunden lang vorbehandelt und dann vor dem ROS-Nachweis zweimal mit Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) gespült . Für den ROS-Nachweis wurden die Zellen mit 10 µM Carboxy-H2DCFDA (6-Carboxy-2′,7′-dichlordihydrofluoresceindiacetat, #C400 Invitrogen) verdünnt in HBSS beladen und 45 Minuten bei 37 °C inkubiert. Der Farbstoff wurde entfernt und die Zellen wurden einmal mit HBSS gespült. Anschließend wurde 1 mM tBH (tert-Butylhydroperoxid, Nr. 458139 Sigma) oder 800 µM H2O2 zugegeben und 6 bzw. 24 Stunden lang inkubiert. Der intrazelluläre ROS-Spiegel wurde bei Ex = 485 nm und Em = 520 nm unter Verwendung eines Plattenlesegeräts (Omega, BMG LABTECH) gemessen und quantifiziert. Nur mit Carboxy-H2DCFDA behandelte Zellen wurden als Basiskontrolle verwendet, mit tBH oder H2O2 allein behandelte Zellen wurden als Oxidationsmittelkontrolle verwendet und unbehandelte Zellen wurden als Hintergrundkontrolle verwendet (von allen anderen Gruppen abgezogen).

iPSC-Medien wurden durch RDM-B18-Medien ersetzt, in denen die B27-Ergänzung durch B18-Ergänzung ersetzt wurde (Neurobasalmedium mit 0,0125 % Katalase, 0,625 % Glutathion, 0,0313 % Humaninsulin, 375 kU/L Rindersuperoxiddismutase, 0,025 % Humanholo- Transferrin, 192 µM T3, 7,75 mM L-Carnitin, 12,5 % Ethanolamin, 694 mM d+-Galactose, 70,9 mM Putrescin, 7,23 µM Natriumselenit, 1,80 mM Corticosteron, 446 µM Linolsäure, 2,24 mM Linolensäure, 3,98 mM Progesteron, 3,81 mM Retinolacetat, 14,5 mM dl-alpha-Tocopherol, 26,4 mM dl-alpha-Tocopherolacetat, 4,43 mM Ölsäure, 968 µM Pipecolinsäure, 512 µM Biotin). Nach 16 Stunden wurden die Medien gesammelt, Proteaseinhibitoren hinzugefügt und die Medien sofort bei –80 °C eingefroren. Die Medien wurden durch RDM-Erhaltungsmedien ersetzt und die B18-Mediensammlung wurde einmal wöchentlich wiederholt. Gefrorene Medien wurden für den ersten Datensatz in 3 biologische Dreifachkopien von 3 verschiedenen Well-Sets und für den zweiten Datensatz in 4 biologische Replikate von 4 verschiedenen Well-Sets gruppiert, wobei das Alter zwischen den Gruppen für die Anzahl der Wochen nach der Passage angepasst wurde. Die Medien wurden aufgetaut und unter Verwendung von Amicon Ultra 15-ml-Zentrifugalfiltern mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 3 kDa und einem Pufferaustausch durch phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) konzentriert. Die endgültige Proteinkonzentration wurde mit dem RC DC Protein Assay (Bio Rad) gemessen. Bei der Planung der vergleichenden Proteomik zwischen diesen beiden Proben haben wir berücksichtigt, dass der Gehalt und die Anzahl der Proteine ​​zwischen apikalen und basolateralen Proben unterschiedlich sein können und daher allen Proben ein exogenes rekombinantes Protein in gleicher Konzentration zugesetzt wurde, um es zur Normalisierung zu verwenden. Recoverin wurde ausgewählt, weil es über mehrere einzigartige Peptide zur Identifizierung in der Massenspektrometrie verfügt und nicht in RPE-Zellen exprimiert wird. Jeder Probe wurde rekombinantes Recoverin in einer Endkonzentration von 0,2 µg/µL zugesetzt. Die endgültigen Peptidhäufigkeiten wurden auf Recoverin normalisiert und um Konzentrationsfaktoren korrigiert, um die Gesamtmenge jedes in apikalen und basolateralen Proben vorhandenen Proteins zu vergleichen.

Proteinproben wurden an die Proteomics Resource Facility der University of Michigan geschickt. Die Tandem-Mass-Tag-Markierung (TMT) und die LC-MS/MS-Analyse wurden wie zuvor beschrieben unter Verwendung von TMT-6-Plex oder TMT-16-Plex (ThermoFisher) und einem Orbitrap Tribid Fusion-Massenspektrometer (Thermo Scientific) durchgeführt38. Die Daten wurden mit Proteome Discoverer 2.1 (Thermo Fisher) analysiert. Signal-Rausch-Werte für jedes Reporterion in den MS/MS-Daten wurden extrahiert und für jedes Peptid summiert und basierend auf dem Recoverin-S/N normalisiert. Die Gesamtintensität über alle Kanäle wurde auf 100 % skaliert. MS/MS-Spektren wurden anhand der UniProt-Datenbank für menschliche Proteine15 durchsucht. Die Pathway-Analyse wurde in iPathwayGuide (Advaita Bioinformatics, Ann Arbor, MI)12 durchgeführt.

Polarisierte iPSC-RPE-Zellen auf Transwells wurden geerntet und die RNA mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen) extrahiert. Komplementäre DNA wurde mit 250 ng Gesamt-RNA unter Verwendung der Reverse Transkriptase SuperScript II (Invitrogen) hergestellt und die Multiplex-RT-gekoppelte PCR wurde am selben Tag in dreifacher Ausfertigung mit POWER SYBR™ Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) für die folgenden Gene durchgeführt: BEST1, CRALBP1, LRAT, MERTK, PEDF und RPE65. PCR-Reaktionen wurden im Biorad iCycler durchgeführt. Die relativen Transkriptwerte wurden auf ACTB normalisiert.

Zur Herstellung konditionierter Medien wurden RDM-konditionierte Medien aus den apikalen und basolateralen Kammern von polarisiertem iPSC-RPE gesammelt, Natriumdodecylsulfat (SDS)-Puffer hinzugefügt, rekombinantes Recoverin zur Normalisierung in einer Endkonzentration von 0,5 nM hinzugefügt und Medien verwendet sofort für die Gelelektrophorese, den Enzymimmunoassay (ELISA) oder bei −80 °C gelagert. Die Proteine ​​wurden mittels SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese (SDS/PAGE) aufgetrennt und auf PVDF-Membranen übertragen. Die Membranen wurden mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS), die 2 % fötales Rinderserum (FBS) und 0,5 % Tween-20 enthielt, blockiert, über Nacht mit primärem Antikörper inkubiert, gewaschen und mit Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugiertem sekundären Antikörper für 1 inkubiert H. Blots wurden mit EcoBright Femto HRP (Innovative Solutions) entwickelt. Die Bänder wurden mit einem Azure c500 (Azure Biosystems) visualisiert und fotografiert. Die Densitometrie-Quantifizierung wurde mit der ImageJ-Software durchgeführt. Die verwendeten Primärantikörper waren: Anti-CRYAB (Enzo, ADI-SPA-223), Anti-RCVRN (Millipore, AB5585) und Anti-RCVRN (Proteintech, 66521-Ig).

Die ELISA-Kits für VEGF (R&D Systems, SVE00), PEDF (R&D Systems, DY117705), CFH (R&D Systems, DY4779) und PTN (Invitrogen, EH370RB) wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Im Fall der PEDF- und CFH-ELISA-Kits wurden die Vertiefungen über Nacht bei Raumtemperatur mit Fängerantikörper (verdünnt in PBS) beschichtet. Anschließend wurden die Vertiefungen 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit Reagenzverdünnungsmittel blockiert. Bei den VEGF- und PTN-ELISA-Kits waren die Platten vorbeschichtet und vorblockiert. Das konditionierte Medium wurde mit Assay-Verdünnungsmittel verdünnt, in dreifacher Ausfertigung auf die vorbeschichtete Platte gegeben und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen wurde der Platte Anti-VEGF, Anti-PEDF, Anti-CFH oder Anti-PTN, konjugiert mit HRP, zugesetzt und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Entwicklung mit H2O2 und dem Chromogen Tetramethylbenzidin wurde die optische Dichte jeder Vertiefung mit einem Mikroplattenlesegerät bestimmt. Standardkonzentrationen von rekombinantem VEGF, PEDF, CFH oder PTN wurden parallel verwendet, um eine Standardkurve zur Berechnung der Konzentrationen zu erstellen.

Die Zellen wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und 15 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, gewaschen und 1 Stunde lang in Blockierungspuffer (3 % Rinderserumalbumin (BSA), 0,3 M Glycin, 0,15 % Triton X-100, 1 % Esel) blockiert Serum). Die Zellen wurden über Nacht bei 4 °C in primärem Antikörper inkubiert, gewaschen und in sekundärem Antikörper mit DAPI (ThermoFisher) und Phalloidin-Konjugat (Biotium, 00050-T) inkubiert. Die verwendeten Primärantikörper waren: Anti-ZO-1 (Invitrogen, 33-9100), Anti-CD147 (BDPharmigen, 563020), Anti-Ezrin (Invitrogen, MA5-13862) und Anti-kir7.1 (Santa Cruz, sc-). 22438). Als Sekundärantikörper wurden verwendet: Ziegen-Anti-Maus-IgG (Jackson Immunoresearch, 715-545-150) und Esel-Anti-Kaninchen-IgG (Jackson Immunoresearch, 711-545-152).

Für Proteomik-Ergebnisse wurden P-Werte mit der Proteome Discoverer-Software unter Verwendung eines Student-T-Tests berechnet, um die apikalen und basolateralen Mittelwerte jedes Proteins zu vergleichen. Angesichts der großen Anzahl der verglichenen Proteine ​​wurde bei der Anpassung für mehrere Vergleiche der Ansatz der falschen Entdeckungsrate von Benjamin und Hochberg verwendet. Als signifikant galten mindestens eine 2,0-fache Veränderung und ein angepasster p-Wert von < 0,05. Zur Analyse der molekularen Funktionen unterschiedlich sezernierter Proteine ​​in Abb. 2B wurde die Analyse von Advaita iPathwayGuide wie zuvor beschrieben durchgeführt13. Kurz gesagt berechnete das Programm die Wahrscheinlichkeit, eine Anzahl unterschiedlich sezernierter Proteine ​​zu beobachten, die einer bestimmten molekularen Funktion zugeordnet sind und die gleich oder größer als die tatsächlich beobachtete Anzahl unterschiedlich sezernierter Proteine ​​für diese molekulare Funktion ist, und der p-Wert wurde auf „falsch“ korrigiert Entdeckungsrate. Für ROS-Erkennungsstudien wurde eine ungepaarte 1-Wege-ANOVA mit einer Tukey-Korrektur für mehrere Vergleiche für die tBH-Experimente verwendet, und ein Kruskal-Wallis-Test mit einer Dunn-Korrektur wurde für die H2O2-Experimente verwendet, da eine ungleiche Stichprobenzahl zu ungleichen Ergebnissen führte Varianz. Für ELISA-Ergebnisse vor und nach oxidativem Stress wurde eine gepaarte 2-Wege-ANOVA mit einer Tukey-Korrektur für mehrere Vergleiche verwendet. P-Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

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Dr. Fahim wurde durch einen K12-Preis (K12EY022299) und einen K08-Preis (1K08EY032991) des National Eye Institute, einen Preis der Choroideremia Research Foundation, einen Eversight Vision-Preis und ein uneingeschränktes Stipendium von Research to Prevent Blindness unterstützt. Diese Arbeit nutzte den Vision Research Core, finanziert durch P30 EY007003 vom National Eye Institute. Für den Inhalt sind ausschließlich die Autoren verantwortlich und geben nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health wieder. Wir danken Patrice Fort, PhD, für den CRYAB-Antikörper.

Abteilung für Augenheilkunde und visuelle Wissenschaften, University of Michigan, Ann Arbor, MI, 48105, USA

Lisheng Chen, N. Dayanthi Perera, Athanasios J. Karoukis, Kecia L. Feathers, Robin R. Ali, Debra A. Thompson und Abigail T. Fahim

KCL Centre for Cell and Gene Therapy, London, WC2R 2LS, England, Vereinigtes Königreich

Robin R. Ali

Abteilung für biologische Chemie, University of Michigan, Ann Arbor, MI, 48105, USA

Debra A. Thompson

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LC trug zum experimentellen Design bei, führte Experimente durch, half bei der Erstellung von Abb. 1 und überarbeitete das Manuskript. NDP pflegte Zellkulturen, führte Experimente durch und half bei der Erstellung von Abbildungen. 1 und 5. AJK pflegte Zellkulturen und führte Experimente durch. KLF führte Experimente durch und überarbeitete das Manuskript. RRA trug zum experimentellen Design bei und überarbeitete das Manuskript. DAT trug zum experimentellen Design bei und überarbeitete das Manuskript. ATF konzipierte die Studie, trug zum experimentellen Design bei, analysierte die Daten, verfasste das Manuskript und bereitete die Zahlen vor. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft und genehmigt.

Korrespondenz mit Abigail T. Fahim.

ATF ist an Ionis Pharmaceuticals beteiligt und ist Berater für Janssen Pharmaceuticals. KLF und DAT erhalten Forschungsunterstützung von MeiraGTx. DAT hat ein Patent auf Gentherapie angemeldet. NDP, AJK, LC und RRA haben keine konkurrierenden Interessen offenzulegen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Chen, L., Perera, ND, Karoukis, AJ et al. Oxidativer Stress wirkt sich unterschiedlich auf die apikale und basolaterale Sekretion angiogener Faktoren aus menschlichen iPSC-abgeleiteten retinalen Pigmentepithelzellen aus. Sci Rep 12, 12694 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-16701-6

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Eingegangen: 20. Dezember 2021

Angenommen: 14. Juli 2022

Veröffentlicht: 26. Juli 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-16701-6

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