Auswirkungen von wiederholtem Schlafentzug auf Gehirnperizyten bei Mäusen

Aug 11, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 12760 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die schädlichen Auswirkungen von Schlafentzug (SD) auf das Gehirnparenchym wurden ausführlich untersucht. Der spezifische Einfluss von SD auf Gehirnperizyten, einen Hauptbestandteil der Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​und der neurovaskulären Einheit (NVU), ist jedoch noch unklar. Die vorliegende Studie untersuchte, wie eine akute oder wiederholte SD die Gehirnperizyten beeinträchtigt, indem die Konzentration des löslichen Blutplättchen-Wachstumsfaktor-Rezeptors Beta (sPDGFRβ) im Liquor cerebrospinalis (CSF) gemessen und die Perizytendichte im Kortex, Hippocampus und im subkortikalen Bereich des PDGFRβ quantifiziert wurde. P2A-CreERT2/tdTomato-Mäuse, die vorwiegend den Reporter tdTomato in Gefäßperizyten exprimieren. Unsere Ergebnisse zeigten, dass eine einmalige 4-stündige SD den CSF-sPDGFRβ-Spiegel nicht signifikant veränderte. Im Gegensatz dazu erhöhte wiederholte SD (4 h/Tag an 10 aufeinanderfolgenden Tagen) den CSF-sPDGFRβ-Spiegel signifikant, was auf explizite Perizytenschäden aufgrund wiederholter SD schließen lässt. Darüber hinaus verringerte wiederholte SD die Perizytendichten im Kortex und Hippocampus signifikant, obwohl der Perizyten-Apoptosestatus unverändert blieb, gemessen mit dem Annexin V-Affinitätsassay und der aktiven Caspase-3-Färbung. Diese Ergebnisse legen nahe, dass wiederholte SD über Nicht-Apoptose-Wege zu einer Schädigung und einem Verlust von Hirnperizyten führt. Diese Veränderungen der Perizyten können zu SD-induzierten BHS- und NVU-Funktionsstörungen beitragen. Die Reversibilität dieses Prozesses impliziert, dass eine Verbesserung des Schlafes eine schützende Wirkung auf die Perizyten des Gehirns haben könnte.

Schlaf reguliert die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​und fördert die Clearance von Metaboliten1,2,3. Beispielsweise ist die Clearance von Amyloid-Beta (Aβ) im Schlaf effektiver als im Wachzustand4. Umgekehrt beeinträchtigen Schlafmangel oder längeres Wachen die Funktion der BHS und werden zu einem Risikofaktor für die Aβ-Akkumulation bei der Alzheimer-Krankheit5,6,7. Aktuelle Erkenntnisse deuten auch darauf hin, dass der Schlaf, insbesondere der Slow-Wave-Schlaf (SWS) oder der Non-Rapid-Eye-Movement-Schlaf (NREM), den zerebralen Blutfluss (CBF) und die Oszillationen der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) für die Metabolitenclearance steuert8,9. Der genaue zelluläre Mechanismus, der die Auswirkungen des Schlafs auf die BHS und andere neurovaskuläre Ereignisse vermittelt, ist jedoch noch unklar. Mit anderen Worten: Die Brücke, die die charakteristischen neuronalen und vaskulären Schwingungen während des SWS verbindet, bleibt unbekannt.

Zu den Wandzellen des Gehirns gehören Perizyten und vaskuläre glatte Muskelzellen (vSMCs). Perizyten sind ein entscheidender Bestandteil der neurovaskulären Einheit (NVU) und der BHS und spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung des CBF, der Aufrechterhaltung der BHS-Integrität, der Freisetzung neurotropher Faktoren und anderen noch zu verstehenden Funktionen10,11,12,13. Die Verengung und Erweiterung der Perizyten steuert die CBF-Fluktuation, die die Grundlage für BOLD-Tools (Blood-Oxygen-Level-Dependent) funktionelle Bildgebungsinstrumente wie funktionelle MRT (fMRT) und PET (Positronenemissionstomographie) bildet, um Veränderungen der neuronalen Aktivität vorherzusagen14. 15,16. Da die CBF- und BHS-Funktionen durch den Schlaf reguliert werden8,9,10,17,18, ist es interessant zu fragen, ob Perizyten eines der zellulären Ziele des Schlafes bei der Meditation seiner Funktionen wie Metabolitenbeseitigung und Aufrechterhaltung der BHS-Integrität sind und ob Schlafstörungen/ Der Verlust beeinträchtigt die Gehirnfunktionen durch die Schädigung von Perizyten. Bisher gibt es nur wenige Studien, die Schlaf oder den Tagesrhythmus mit Perizyten in Verbindung bringen. Eine Studie zeigte, dass das Ausschalten des Clock-Gens bmal1 (Gehirn- und Muskel-Arnt-ähnliches Protein-1) zu einem schweren Verlust von Perizyten und tiefgreifenden Veränderungen der BHS-Permeabilität führt19, was auf die Bedeutung des zirkadianen Rhythmus für die Gesundheit der Perizyten schließen lässt. Eine aktuelle Studie zeigte, dass die Expression des bmal1-Gens in Perizyten die Gefäßreifung in einem 3D-Gewebegerüstmodell fördert20. Die andere Studie zeigte, dass Schlafverlust durch schnelle Augenbewegungen (REM) bei Ratten die Ablösung von Perizyten von den Kapillarwänden induziert21. Die vorliegende Studie untersucht eingehend den Perizytenschaden, der durch akuten (ASD, einmalig, 4 Stunden) und wiederholten Schlafentzug (RSD, 4 Stunden/Tag an 10 aufeinanderfolgenden Tagen) verursacht wird, mit einem Modell, das sowohl REM- als auch NREM-Schlaf durch Liquorplättchen entzieht Messung des abgeleiteten Wachstumsfaktor-Rezeptors Beta (PDGFRβ) und eine auf Durchflusszytometrie basierende Methode zur Perizytenquantifizierung. Eine Erholungsgruppe (RSDR, 3 Wochen Erholung nach RSD) wurde eingeschlossen, um zu untersuchen, ob die SD-induzierten Perizytenveränderungen reversibel waren (Abb. 1, Flussdiagramm).

Ablaufdiagramm des Experiments: Die ASD-Gruppe erhielt am 30. Tag einmal SD; Die RSD-Gruppe erhielt zwischen Tag 21 und 30 10 Tage SD; Die RSDR-Gruppe erhielt zwischen Tag 1 und 10 10 Tage SD; Der Kontrollgruppe (SDC) wurde keine SD auferlegt. Alle Mäuse erhielten zwischen Tag 12 und 16 Tamoxifen-Injektionen und wurden zwei Wochen nach der Tamoxifen-Injektion (Tag 31) getötet. Somit war die Dauer der tdTomato-Expression in allen Gruppen gleich.

Pdgfrβ-P2A-CreERT2/tdTomato-Mäuse exprimieren Reporter tdTomato in Gefäßperizyten nach Tamoxifen-Induktion. In Übereinstimmung mit anderen Studien mit ähnlichen PDGFRβ-Promotor-basierten Mausmodellen zeigte das durch die Tamoxifen-Injektion induzierte tdTomato-Fluoreszenzsignal vorherrschende perivaskuläre Lokalisationen, die Arteriolen, Kapillaren und Venolen im Gehirn der Maus umfassen22,23,24. Allerdings waren die hervorstehenden eiförmigen tdTomato+-Somata, die für Perizyten charakteristisch sind, vorwiegend in der Kapillarwand, der präkapillären Arteriole und der postkapillären Venolenwand verteilt. Durch tdTomato-Fluoreszenz dargestellte Kapillarperizyten erstrecken sich entweder als dünner Fortsatz um das Gefäßlumen (dünnsträngige Perizyten) oder haben netzartige Fortsätze (Netzperizyten). TdTomato+-Somata wurden selten im Gehirnparenchym, in der penetrierenden Arteriole und in der aufsteigenden Venole beobachtet (Abb. 2A, B).

(A–B) Verteilungen von tdTomato+-Perizyten im Kortex einer Maus in der Kontrollgruppe. I: Einzelstrangperizyten; II: Netzperizyten. PA: Durchdringende Arteriole; PV: Penetrierende Vene. (CF): Blutgefäße markiert mit Lektin (grün), tdTomato (rot) und CD13 (blau). Pfeile in Panel (F) zeigen CD13+/tdTomato+-Kapillarperizyten. Maßstabsbalken = 25 µm.

Um die Perizytenspezifität der tdTomato-Expression zu überprüfen, untersuchten wir die gemeinsame Markierung der tdTomato mit der Immunfärbung von CD13 (Aminopeptidase N), einem primären Oberflächenmarker für Gehirnperizyten25,26. In Gehirnschnitten variierte die Verteilung der CD13-Immunreaktivitäten. Offensichtliche CD13-Immunreaktivitäten waren in den meisten Gehirnbereichen vorhanden, wo etwa 98 % der CD13+-Zellen auch tdTomato (CD13+/tdTomato+) exprimierten (Abb. 2C, F). Wir stellten jedoch fest, dass in einigen kortikalen und subkortikalen Bereichen, in denen zahlreiche tdTomato+-Zellen und Lektin-markierte Blutgefäße vorhanden waren, CD13-Immunreaktivitäten fehlten oder sehr schwach waren (Abb. 3). Da es unwahrscheinlich ist, dass Kapillaren und Perizyten in so ausgedehnten Hirnregionen fehlen, gehen wir davon aus, dass die negative CD13-Markierung in diesen Hirnregionen wahrscheinlich auf die Beschränkung der Immunfärbungstechnik zurückzuführen ist, die eine CD13-Expression auf niedrigem Niveau möglicherweise nicht erkennen kann. Das gleiche Verteilungsmuster galt auch für die PDGFRβ-Immunfärbung (siehe ergänzende Abbildung S1). Daher haben wir in der folgenden Durchflusszytometriestudie den genetischen Reporter tdTomato anstelle von CD13 für die Perizytenquantifizierung verwendet, um eine Unterschätzung der Perizytendichten zu vermeiden.

Die Diskrepanz zwischen CD13-Immunfärbung und tdTomato-Expression im Hinblick auf die Perizytenmarkierung. Panel (C) zeigt dichte CD13-Immunreaktivitäten im gelb umkreisten Bereich im motorischen Kortex einer Kontrollmaus. Allerdings waren die CD13-Immunreaktivitäten im angrenzenden weiß eingekreisten Bereich gering oder nicht nachweisbar, obwohl beide Bereiche eine ähnliche Menge an Lektin- (A) und tdTomato-Verteilungen (B) aufwiesen. Gelbe Pfeile zeigen die CD13+/tdTomato+-Zellen. Weiße Pfeile zeigen die CD13-/tdTomato+-Zellen an. Maßstabsbalken = 50 µm.

Verletzte Hirnperizyten geben sPDGFRβ in den Liquor ab. Daher ist ein erhöhter sPDGFRβ-Spiegel im Liquor zu einem empfindlichen Marker für eine Perizytenschädigung geworden. Die CSF-sPDGFRβ-Spiegel in der Kontrollgruppe (SDC), den ASD-, RSD- und RSDR-Gruppen wurden mit einem ELISA-Assay gemessen. Der durchschnittliche CSF-sPDGFRβ-Spiegel bei den SDC-Mäusen betrug 1964 ± 638,0 pg/ml, fast die Hälfte des CSF-sPDGFRβ-Spiegels junger Menschen27. Die ANOVA-Analyse zeigte signifikante Unterschiede im sPDGFRβ-Spiegel zwischen vier Gruppen (F3,24 = 10,39, p = 0,0001). ASD veränderte den CSF-sPDGFRβ-Spiegel nicht signifikant (2052 ± 513,9 pg/ml, t = 0,11 dF = 24, p > 0,99 im Vergleich zur SDC-Gruppe). Allerdings erhöhte RSD den sPDGFRβ-Spiegel im Liquor dramatisch, fast dreimal so hoch wie in der SDC-Gruppe (5827 ± 2821,0 pg/ml. t = 4,64 bzw. 5,01 im Vergleich zu SDC- bzw. ASD-Gruppen, dF = 24, p < 0,001). Eine dreiwöchige Erholung senkte den CSF-sPDGFRβ-Spiegel auf den Ausgangswert (2945 ± 595,3 pg/ml, t = 1,14, dF = 24, p > 0,99 im Vergleich zur SDC-Gruppe) (Abb. 4). Der unveränderte CSF-sPDGFRβ-Spiegel bei ASD deutete darauf hin, dass eine einmalige 4-stündige SD keine nennenswerte Schädigung der Perizyten verursachte. Daher haben wir die ASD-Gruppe nicht in die folgenden Durchflusszytometrie-Experimente einbezogen, um die Anzahl der verwendeten Tiere zu minimieren.

Die Ergebnisse des ELISA-Tests zeigten, dass der CSF-sPDGFRβ-Spiegel in der RSD-Gruppe im Vergleich zu anderen Gruppen signifikant höher war (**: p < 0,001; *: p < 0,05).

Gespaltene Caspase-3 ist ein wertvoller Marker für Apoptose und kann in gesunden Zellen normalerweise nicht nachgewiesen werden. Erhöhte gespaltene Caspase-3-Immunreaktivitäten im Zytoplasma von Hirnparenchymzellen wurden bei den RSD-Mäusen beobachtet, die gespaltenen Caspase-3+/tdTomato+-Zellen wurden jedoch selten in allen Gruppen beobachtet, was darauf hindeutet, dass es keine ausgeprägte Perizyten-Apoptose gab, die durch wiederholte SD induziert wurde ( Abb. 5A–C, ergänzende Abb. S5).

(A–C) Ergebnisse der gespaltenen Caspase-3-Immunfärbung im Kortex einer RSD-Maus. Im Hirnparenchym wurden positive Immunreaktivitäten (Pfeile) beobachtet, die jedoch nicht gleichzeitig mit der tdTomato-Fluoreszenz lokalisiert waren. (D–F) Lektinfärbung im Kortex von SDC- (D), RSD- (E) bzw. RSDR-Mäusen (F). Es wurde keine signifikante Änderung der Gefäßdichte beobachtet. Maßstabsbalken = 50 µm.

Lektin (Lycopersicon esculentum) wird aufgrund seiner Fähigkeit, sich an die Basalmembran von Endothelzellen (ECs) zu binden, häufig zur Visualisierung von Blutgefäßen verwendet. Der Prozentsatz der durch Lektinfärbung abgedeckten Fläche ist ein zuverlässiger Indikator für die Gefäßdichte und wurde in vielen Studien zur Quantifizierung von Blutgefäßen verwendet. Wir fanden keine signifikanten Gruppenunterschiede in der Gefäßflächendichte im Kortex und Hippocampus zwischen allen drei Gruppen, was darauf hindeutet, dass unser SD-Verfahren die Gesamtstruktur der Blutgefäße im Gehirn nicht wesentlich veränderte oder schwere EK-Schäden/-Verluste verursachte (Abb. 5, DF). ; Ergänzende Abbildung S2).

Die TdTomato-Fluoreszenz im Gehirn war stark und erstreckte sich über das gesamte Gefäßsystem, wodurch einige tdTomato+-Somata nicht erkennbar waren, was zu einer Verzerrung führt, wenn wir Perizyten auf Gehirnschnitten mit der traditionellen Morphometriemethode zählen. Daher haben wir die Methode der Durchflusszytometrie angewendet, um Perizyten in drei Gehirnbereichen (Kortex, Hippocampus und subkortikale Bereiche) zu quantifizieren. In der SDC-Gruppe waren etwa 5,33 ± 1,19 % der Hippocampuszellen, 10,53 ± 0,84 % der kortikalen Zellen und 9,68 ± 3,64 % der subkortikalen Zellen tdTomato+-Zellen. Der von uns erhaltene Bereich der Perizytendichte ist viel höher als der der Studie von Crouch aus dem Jahr 2018 (~ 2 %), aber vergleichbar mit der Studie von Spitzer aus dem Jahr 2013 (10–20 %)26,28. Faktoren wie Gewebeisolierungsverfahren, Verdauungsproteasekonzentration und Antikörperauswahl können die Ergebnisse der Durchflusszytometrie beeinflussen. Um aussagekräftige Vergleiche zu ermöglichen, stellten wir sicher, dass alle Versuchsbedingungen in allen Gruppen konsistent waren.

Zehn Tage wiederholte SD verringerten die tdTomato+-Zelldichten im Hippocampus signifikant auf 3,17 ± 0,46 % (t = 4,15 dF = 15, p = 0,0026) und im Kortex auf 8,17 ± 1,45 % (t = 3,30, dF = 15, p = 0,015). ). Die tdTomato+-Zelldichten im subkortikalen Bereich unterschieden sich zwischen den drei Gruppen nicht signifikant. Nach einer dreiwöchigen Erholung von wiederholter SD wurden die Dichten der tdTomato+-Zellen im Kortex und Hippocampus wieder auf das Ausgangsniveau gebracht (Abb. 6). Die Dichte der apoptotischen Perizyten (tdTomato+/Annexin V+) war in allen drei Gehirnregionen sehr niedrig, und die Unterschiede in der apoptotischen Perizytendichte (Verhältnis von tdTomato+/Annexin V+-Zellen zu tdTomato+-Zellen) zwischen jeder Gruppe waren unbedeutend (Abb. 7).

(A) Repräsentative Fotos von Perizytendichten (tdTomato+), gemessen mit Durchflusszytometrie in drei Regionen. (B–D) Vergleiche der Perizytendichte zwischen drei Gruppen in verschiedenen Gehirnbereichen. RSD reduzierte die Perizytendichten im Hippocampus (B) und Kortex (C) signifikant (*: p < 0,05; **: p < 0,01). Nach einer dreiwöchigen Erholung waren die Perizytendichten im Hippocampus und im Kortex jedoch wiederhergestellt, ohne signifikanten Unterschied zur SDC-Kontrollgruppe.

(A) Repräsentative Fotos der Verhältnisse von tdTomato+/Annexin V+-Zellen zu tdTomato+-Zellen, gemessen mit Durchflusszytometrie in drei Gehirnbereichen. (B–D) Vergleich der Dichten apoptotischer Perizyten (tdTomato+/Annexin V+). Zwischen allen drei Gruppen wurde kein signifikanter Unterschied festgestellt.

Zu den vaskulären Wandzellen des Gehirns gehören glatte Muskelzellen (vSMC) und Perizyten. Perizyten sind im Mikrogefäßsystem des Zentralnervensystems (ZNS) sehr häufig anzutreffen. Bei verschiedenen ZNS-Erkrankungen wurde über eine Schädigung oder einen Verlust von Hirnperizyten berichtet, darunter ischämischer Schlaganfall, Alzheimer-Krankheit (AD) und diabetische Retinopathie29,30,31,32,33. Unsere Studie zeigte, dass wiederholter Schlafentzug (SD) die Perizyten sowohl auf molekularer als auch auf zellulärer Ebene beeinträchtigte.

SD ist ein traditioneller Ansatz zur Untersuchung der Funktion des Schlafes und der Auswirkungen von Schlaflosigkeit oder längerem Wachen bei Tieren. Allerdings führen häufig verwendete Methoden wie sanfte Handhabung, Radlaufen, Scheibe-über-Wasser oder mehrere Plattformen häufig zu teilweiser SD (z. B. nur REM-SD) oder häufigem Aufwachen/Erregen, übermäßigen Fortbewegungsaktivitäten und unvermeidbarem systematischen Stress die die tatsächlichen Auswirkungen von Schlafmangel verwirren34,35,36,37. Um diese Nachteile zu beheben, wurde das automatisierte SD-System auf der Basis rotierender Stangen entwickelt. Die Fernsteuerung des Drehstabs minimiert den vom Experimentator verursachten Stress, während die einstellbare Drehgeschwindigkeit verhindert, dass die Tiere in den Schlaf abdriften. Darüber hinaus ist unser rotierendes Stangensystem einzigartig, da die Mäuse nicht aktiv über die Stange laufen müssen; Stattdessen werden durch die Höhe der Stange sanfte Stöße auf den Kopf oder die Schulter ausgeübt, um Tiere zu wecken, ohne ihre Fortbewegung merklich zu erhöhen (siehe ergänzende Abbildung S4). Infolgedessen können die in unserer Studie festgestellten Veränderungen der Perizyten ausschließlich auf SD und nicht auf Fortbewegung zurückgeführt werden. Zur Validierung unseres SD-Systems wurde eine 24-Stunden-EEG/EMG-Aufzeichnung durchgeführt (siehe ergänzende Abbildungen S3 und S4).

Bei Mäusen wird PDGFRβ überwiegend in Perizyten exprimiert38, während beim Menschen sowohl Perizyten als auch vSMCs PDGFRβ exprimieren, wobei die relative Proteinhäufigkeit von PDGFRβ in Perizyten viermal höher ist als in vSMCs39. Wichtig ist, dass PDGFRβ in Perizyten, jedoch nicht in vSMCs, bei Hypoxie und anderen Verletzungen gespalten und in den Liquor abgegeben wird. Somit ist ein erhöhter CSF-PDGFRβ zu einem empfindlichen Biomarker für Perizytenschäden geworden, der mit dem Abbau der Blut-Hirn-Schranke und frühen kognitiven Dysfunktionen beim Menschen assoziiert ist27,31,39,40,41. Soweit wir wissen, ist dies das erste Mal, dass CSF sPDGFRβ bei Mäusen gemessen wurde.

Eine einmalige 4-stündige ASD konnte den sPDGFRβ-Spiegel nicht erhöhen. Allerdings verursachte RSD einen dreifachen Anstieg des sPDGFRβ-Spiegels im Liquor, was darauf hindeutet, dass RSD schwere pathologische Veränderungen in Perizyten verursachte, einschließlich der Abgabe des abgebauten Membranrezeptors PDGFRβ in den Liquor. Da der von Blutplättchen abgeleitete Wachstumsfaktor (PDGF), der endogene Ligand von PDGFRβ, von den ECs sezerniert wird, kann der schnelle und massive Verlust des Oberflächenrezeptors PDGFRβ den normalen Crosstalk zwischen Perizyten und den ECs stören, der für die Perizytenproliferation entscheidend ist. Migration und kann daher letztendlich zum Absterben von Perizyten führen42,43,44. Dennoch gelang es Mäusen, denen nach der gleichen 10-tägigen wiederholten SD-Prozedur eine 3-wöchige Erholungsphase verabreicht wurde, den CSF-sPDGFRβ-Spiegel auf dem Ausgangsniveau zu halten, was darauf hindeutet, dass Perizyten die PDGFRβ-Abgabe nach Abschaffung der SD gestoppt haben.

Schlaf ist für verschiedene physiologische Funktionen und die Homöostase unerlässlich. Das moderne Verständnis besagt, dass ein komplexer neuronaler Schaltkreis im Gehirn die Schlaf-/Wachzustände reguliert, und zwar unter der Kontrolle zweier interner biologischer Mechanismen – des Tagesrhythmus und der Homöostase45. Es gibt jedoch zunehmend Hinweise darauf, dass viele nicht-neuronale Elemente, wie etwa die Gliazellen, das mikrovaskuläre System, die Blut-Hirn-Schranke und das Immunsystem, auch neuronale Schaltkreise oder lokale Neuronen beeinflussen und erheblich zur Schlafregulation und Schlafhomöostase beitragen3,46,47,48 .

Daher könnte SD nicht nur neuronale Substrate schädigen, sondern auch diese nicht-neuronischen Elemente, zu denen möglicherweise die Gehirnperizyten gehören, da sie ein wichtiger Bestandteil der BHS und NVU sind. Es gibt jedoch kaum direkte Beweise für die Wechselwirkungen zwischen Schlaf und Perizyten. Indirekte Hinweise deuten darauf hin, dass Veränderungen der BHS-Permeabilität, die durch den zirkadianen Rhythmus und Schlafverlust verursacht werden, durch Perizyten vermittelt werden1,3,10,17,18. Bisher hat nur eine veröffentlichte Studie die direkte Wirkung von SD auf Perizyten untersucht und dabei festgestellt, dass SD die Interaktion zwischen Perizyten und ECs störte und die mikrovaskulären PDGFRβ-Spiegel im Gehirngewebe von Ratten senkte21. Das in dieser Studie verwendete Multi-Plattform-Modell führte jedoch zu einer teilweisen SD, die den größten Teil des REM-Schlafs reduzierte, aber nur einen Teil des NREM-Schlafs49.

Da die potenzielle Beteiligung von Perizyten an der Erzeugung von CBF- und CSF-Oszillationen hauptsächlich während des NREM-Schlafs (oder des Slow-Wave-Schlafs) auftritt8,50, gehen wir davon aus, dass ein SD-Verfahren, das zum Verlust sowohl des NREM- als auch des REM-Schlafs führt, einen größeren Einfluss darauf haben könnte Perizyten. Tatsächlich haben wir gezeigt, dass unser wiederholtes SD-Modell zu einem signifikanten Perizytenverlust in der Großhirnrinde und im Hippocampus führte, begleitet von erhöhten CSF-sPDGFRβ-Spiegeln. Diese Veränderungen tragen unweigerlich zu den bei SD beobachteten BHS- oder NVU-Schäden bei.

Die Mechanismen, die diese Perizytenverluste oder -anomalien vermitteln, sind noch unklar. Frühere Studien haben gezeigt, dass Gehirn- oder Netzhautperizyten unter bestimmten Bedingungen Apoptose erleiden, wie z. B. hoher Glukosespiegel und Alzheimer-Krankheit29,51,52. Der SD-induzierte Perizytenverlust kann jedoch unterschiedliche Mechanismen haben, da in unserer Studie keine signifikanten Signale der Perizytenapoptose festgestellt werden konnten. In Übereinstimmung mit unseren Ergebnissen fand die Studie von Medina-Flores auch keine Veränderung im Expressionsniveau von aktivierter Caspase-3 in isolierten Gehirnmikrogefäßen von Ratten, denen der Schlaf entzogen war. Nekrose (nicht-apoptotischer Zelltod) ist der andere primäre Mechanismus des Zelltods, der durch Annexin V−/PI+-Färbung in der Durchflusszytometriestudie sichtbar gemacht werden konnte. Unsere Daten waren jedoch für die Berechnung der SD-induzierten Nekrose ungeeignet, da einige dieser Annexin V−/PI+-Zellen durch die Gewebevorbereitungsverfahren absterben könnten.

Zusätzlich zum Zelltod kann der SD-induzierte Perizytenverlust auf den Übergang von Perizyten zu anderen Zelltypen zurückzuführen sein. Studien haben gezeigt, dass Perizyten unter bestimmten Umständen in vitro und in vivo das Potenzial haben, sich in andere gewebespezifische Zelltypen zu differenzieren53,54,55,56. Beispielsweise können Gehirnperizyten einen Mikroglia-Phänotyp erwerben, indem sie nach einem ischämischen Schlaganfall Mikroglia-Marker wie IBA1 exprimieren57. Daher sind weitere Studien erforderlich, um den genauen Mechanismus des SD-induzierten Perizytenverlusts zu erklären.

Gefäß-ECs sind ein weiterer wichtiger Bestandteil der BHS. Obwohl mehrere Studien gezeigt haben, dass SD die Endothelfunktionen beeinträchtigen und zu kardiovaskulären Dysfunktionen wie Bluthochdruck beitragen kann58,59, wurde nicht über SD-induzierte erhebliche EC-Schäden oder -Verluste berichtet. Tatsächlich kommt es nur bei schweren Hirnverletzungen wie einem ischämischen Schlaganfall oder einer neurodegenerativen Ataxie zu einem massiven EK-Tod oder -Verlust, wenn der mikrovaskuläre Zusammenbruch auftritt60,61. Durch den Vergleich der Prozentsätze der mit Lektin gefärbten Bereiche in den drei Gruppen konnten wir keine signifikanten Veränderungen der Gefäßdichte im Kortex und Hippocampus feststellen. Dieser Befund legt nahe, dass unser wiederholtes SD-Verfahren keine nennenswerten Veränderungen in den ECs und der gesamten Blutgefäßstruktur verursachte. Dies impliziert auch, dass Perizyten empfindlicher auf SD reagieren als ECs und der durch wiederholte SD verursachte Perizytenverlust nicht die Folge eines massiven Verlusts von Mikrogefäßen war.

Ein weiteres wichtiges Ergebnis der vorliegenden Studie ist, dass der Perizytenschaden und -verlust, der durch 10-tägige wiederholte SD verursacht wird, rückgängig gemacht werden könnte, wenn der normale Schlaf-Wach-Zyklus wiederhergestellt würde. Die starke Fähigkeit des Perizyten zur Proliferation und Reparatur könnte diese Umkehrung erklären42. Diese Kapazitäten sind auch für die Reparatur von Mikrogefäßen und die Aufrechterhaltung der BHS- und NVU-Integrität unter anderen physiologischen und pathologischen Bedingungen von entscheidender Bedeutung.

Anstelle eines vollständigen oder erweiterten SD-Modells wurde in der vorliegenden Studie ein moderates SD-Modell (4 Stunden/Tag) verwendet, da leichte bis mittelschwere SD im Alltag klinisch häufiger vorkommen als vollständige SD62. Daher wissen wir nicht, ob eine schwerwiegendere SD (> 4 Stunden/Tag und > 10 Tage) oder eine vollständige SD zu irreversiblen Schäden oder Verlusten der Perizyten führen könnte. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass wir die SD-induzierten Änderungen der BBB-Permeabilität nicht gemessen haben. Daher können wir die möglichen Zusammenhänge zwischen Perizytenverlust oder erhöhtem sPDGFRβ-Spiegel und BHS-Schädigung nicht untersuchen. Zukünftige Studien sollten ein erweitertes SD-Modell testen und gleichzeitige Änderungen der Marker anderer NVU- oder BBB-Komponenten untersuchen. Darüber hinaus wird ein Tiermodell benötigt, mit dem ZNS-Kapillarperizyten präzise angesteuert werden können, um die komplexen zellulären Wechselwirkungen innerhalb der NVU und der BHS während der normalen oder pathologischen Schlaf-/Wachregulation zu untersuchen.

Wir identifizierten Zellschäden und -verluste, die durch wiederholte SD an Hirnperizyten hervorgerufen wurden, einem kritischen Bestandteil der vaskulären Wandzellen des Gehirns. Diese Perizytenveränderungen tragen wahrscheinlich zum Abbau der Blut-Hirn-Schranke und zur Funktionsstörung der Mikrozirkulation im Gehirn während chronischer SD bei. Umgekehrt deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass eine Verbesserung des Schlafes die Perizyten schützen und vor perizytenbedingten pathologischen Zuständen wie der Alzheimer-Krankheit im Gehirn schützen könnte.

Wir haben die Reportermäuse Pdgfrβ-P2A-CreERT2 (Jax # 030201)24 und Ai14 tdTomato (Jax #007914) gekreuzt, um die Pdgfrβ-P2A-CreERT2/tdTomato-Mäuse zu erhalten, in denen Reporter-tdTomato nach der Induktion hauptsächlich in Perizyten exprimiert wird Tamoxifen-Injektion (75 mg/kg Körpergewicht, ip einmal alle 24 Stunden an insgesamt 5 aufeinanderfolgenden Tagen). Tierzucht und -manipulation folgten den Richtlinien des National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals und des Institutional Animal Care and Use Committee (Protokoll Nr. IACUC-01399). Alle Mäuse wurden in einer 12-Stunden-/12-Stunden-Hell-/Dunkel-Umgebung mit eingeschaltetem Licht zur Zeitgeberzeit 0 (ZT00) gehalten und nach Belieben mit Standard-Nagetierfutter und Wasser gefüttert. Die Umgebungstemperatur und die Luftfeuchtigkeit wurden zwischen 22 und 24 °C bzw. 40–60 % gehalten. Zwei Kohorten von 6–8 Monate alten PDGFRβ-P2A-CreERT2/tdTomato-Mäusen (einschließlich beider Geschlechter) wurden nach dem Zufallsprinzip der Kontrollgruppe (SDC), der akuten SD-Gruppe (ASD), der 10 Tage wiederholten SD-Gruppe (RSD) und der Gruppe zugeordnet Erholungsgruppe (RSDR, RSD+ 3 Wochen Erholung) mit 5–9 Mäusen in jeder Gruppe. Der Zeitrahmen der Tamoxifen-Induktion, der SD-Verfahren und der Gewebeentnahme ist in Abb. 1 aufgeführt. Eine Kohorte von Mäusen wurde für die CSF-Sammlung und Histologie verwendet; Die andere Kohorte wurde für die Durchflusszytometrie verwendet.

Den Mäusen wurde der Schlaf entzogen, indem ein automatisiertes Schlafentzugssystem mit einer motorisierten Drehstange am Käfigboden eingesetzt wurde. Die Wirksamkeit ähnlicher Geräte zur Erzeugung von SD wurde bereits zuvor validiert63,64. Kurz gesagt, die Mäuse wurden während des Experiments in Gruppen in Käfigen gehalten, die eine rotierende Stange enthielten. Alle Mäuse wurden an diese neuen Käfige gewöhnt, indem sie während der dunklen (aktiven) Phase 5 Minuten pro Stunde den rotierenden Stab (6–10 U/min) einschalteten. Anschließend wurde ein 4-Stunden-ASD (ZT00-04) oder ein 10-Tage-RSD (4 Stunden/Tag, ZT00-04) erstellt, indem der rotierende Balken kontinuierlich in den festgelegten Zeitrahmen aktiviert wurde. Der rotierende Stab stößt Mäuse sanft an und verhindert so das Einschlafen, ohne ihre Bewegungsaktivitäten wesentlich zu steigern. Bei den Kontrollmäusen blieb der rotierende Stab während der leichten (inaktiven) Phase still. Das Verhalten der Mäuse während der SD wurde auf Video aufgezeichnet, um zu bestätigen, dass die SD-Prozeduren ungestört verliefen und die Mäuse während der gesamten SD-Prozedur wach gehalten wurden.

Maus-CSF wurde wie in Lims Protokoll65 beschrieben gesammelt. Kurz gesagt, unter Narkose (1 % Isofluran-Inhalation) wurde die Cisterna magna freigelegt, indem benachbarte Muskeln entfernt wurden. Anschließend wurde eine saubere Glaskapillare in die Cisterna magna eingestochen und Liquor automatisch in das Kapillarröhrchen gesaugt. Wir erhielten 8–15 µl CSF pro Maus. Um mögliche Schwankungen der sPDGFRβ-Konzentration aufgrund der zirkadianen Zeit zu vermeiden, sammeln wir immer CSF-Proben bei ZT05-06. Anschließend wurde der Standard-Sandwich-ELISA-Assay gemäß dem Protokoll des Herstellers (Abcam, Cambridge, MA) durchgeführt. Die Platte wurde sofort auf dem BioTek Synergy 4-Lesegerät gelesen. Die Konzentrationen löslicher PDGFRβ (sPDGFRβ) wurden anhand der Messwerte der Proben und der linearen Standardkurvengleichung berechnet. Die Ergebnisse wurden mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert, um die Endkonzentration in den ursprünglichen CSF-Proben zu ermitteln.

Zur Quantifizierung der Perizyten im Gehirngewebe von Mäusen wurde eine Durchflusszytometrie auf der Grundlage veröffentlichter Protokolle26,28 durchgeführt. Kurz gesagt, Mäuse wurden mit 10 ml PBS perfundiert und die bilaterale Großhirnrinde, der Hippocampus und der subkortikale Bereich (zwischen dem Colliculus inferior und dem vorderen Corpus callosum) entnommen. Hirngewebe wurde mit 2 % fötalem Rinderserum/phosphatgepufferter Kochsalzlösung (FBS/PBS) gespült, in 1 mm lange Stücke geschnitten und in Komplettmedium mit 3 mg/ml Kollagenase/Dispase (Sigma, St. Louis, MO) inkubiert. für 45 min bei 37 °C unter ständigem Schütteln. Anschließend wurde das Gehirngewebe etwa 100-fach mit einer P1000-Pipette verrieben (auf- und abpipettieren), und der Überstand wurde abgeseiht und 5 Minuten lang bei 300 g zentrifugiert. Die Pellets wurden in 22 % Percoll (Sigma, St. Louis, MO) resuspendiert und 10 Minuten lang bei 2600 g zentrifugiert. Die Blutzellen wurden mit Lysepuffer für rote Blutkörperchen (Sigma, St. Louis, MO) und einem 40-μm-Zellsieb entfernt. Die Pellets wurden in PBS mit 2 % FBS/PBS resuspendiert und die Zelldichte gemessen. Die Mehrfarben-Durchflusszytometrie wurde gemäß Standardtechniken mit einem CytoFLEX LX (Beckman Coulter) unter Verwendung von Filtern für tdTomato (Perizyten), Annexin V-Pacific Blue (Thermofisher, Waltham MA, für Apoptose) und Propidiumiodid (PI, Thermofisher, Waltham MA, für tote Zellen).

Unmittelbar nach der CSF-Entnahme wurden die Mäuse transkardial mit PBS-Lösung mit 10 % Formalin perfundiert, und die Gehirne wurden auf einem Kompresstom (Precisionary Instruments, Greenville, NC) mit einer Dicke von 40 µm geschnitten. Die Gehirnabschnitte wurden in vier Sätze unterteilt. Ein Schnittsatz wurde mit Lectin-DyLight 488 (Verdünnung 1:200, Thermofisher, Waltham MA) und monoklonalem Kaninchen-Anti-CD13-Antikörper (ab32570, Verdünnung 1:4000, Abcam, Cambridge MA) gefärbt, um die Identität tdTomato-exprimierender Zellen zu überprüfen Standorte. Andere Schnitte wurden mit monoklonalem Kaninchen-Anti-gespaltenem Caspase-3-Antikörper (1:1000-Verdünnung, Cell Signaling, Danvers, MA) gefärbt, um apoptotische Zellen nachzuweisen. Als Sekundärantikörper wurde Alexa Fluor-647 Esel-Anti-Kaninchen-IgG verwendet. Zur quantitativen Analyse der Gefäßdichte wurden 8 mit Lektin gefärbte koronale Schnitte (2 bei AP + 0,6; 2 bei AP-0,9; 2 bei AP-1,6; 2 bei AP-2,3-Niveau) gescannt und hochauflösende Bilder aufgenommen unter Verwendung des konfokalen Mikroskops Zeiss LSM 880. Die Bilder wurden dann in die NIH ImageJ-Software übertragen. Basierend auf Fluoreszenzintensitäten im Bereich von 0 bis 255 wurden Blutgefäße von Hintergrundsignalen unterschieden, indem ein Schwellenwert von 30 festgelegt wurde, der in allen drei Gruppen konstant war. Untersucht wurden die kortikalen Bereiche, die den primären und sekundären motorischen Kortex, den primären und sekundären somatosensorischen Kortex und die gesamte Hippocampusstruktur abdecken. Die Gefäßflächendichte wurde durch das Flächenverhältnis der mit Lektin gefärbten Fläche zur gesamten interessierenden Fläche bestimmt66,67.

Die Daten wurden mit GraphPad Prism 9.2 (GraphPad Software, Boston, MA) analysiert. Eine Einweg-ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Test wurde verwendet, um den CSF-sPDGFRβ-Spiegel, die Perizytendichte und die Gefäßflächendichte zwischen den Gruppen zu vergleichen. Die statistische Signifikanz wurde auf dem Niveau p < 0,05 (zweiseitig) bewertet68.

Sämtliche Tierpflege und -verfahren folgten den Richtlinien des National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals und wurden gemäß den ARRIVE-Richtlinien gemeldet. Alle an den Mäusen vorgenommenen Manipulationen wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Medical University of South Carolina genehmigt (Protokoll Nr. IACUC-2021-01399).

Alle im Rahmen dieser Studie generierten oder analysierten Daten können auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor angefordert werden.

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Die Autoren danken Jacob Kendrick für die Hilfe bei den Durchflusszytometrie-Experimenten.

Dieses Projekt wurde von NIH RF1AG077570 (Liu), R21AG067445 (Liu), R01NS096151 (Liu) und R01GM130653 (Fan) unterstützt.

Abteilung für Psychiatrie und Verhaltenswissenschaften, Medizinische Universität von South Carolina, Charleston, SC, 29425, USA

Yan Wu & Meng Liu

Pathologie und Labormedizin, Medical University of South Carolina, Charleston, SC, 29425, USA

Pengfei Li & Hongkuan Fan

Neurowissenschaften, Medical University of South Carolina, Charleston, SC, 29425, USA

Narayan Bhat

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ML und HF haben die Studie entworfen; YW und PL führten Untersuchungen durch; ML, HF und NB analysierten Daten; ML hat die Arbeit geschrieben. Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: YW und PL

Korrespondenz mit Meng Liu.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Wu, Y., Li, P., Bhat, N. et al. Auswirkungen von wiederholtem Schlafentzug auf Gehirnperizyten bei Mäusen. Sci Rep 13, 12760 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40138-0

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Eingegangen: 24. März 2023

Angenommen: 05. August 2023

Veröffentlicht: 07. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40138-0

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